Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding
Summary
Un<em> In vitro</emMetodo> per la preparazione funzionale del recettore dei glucocorticoidi (GR) • hsp90 complessi proteici da proteine purificate e lisati cellulari è descritto. Il metodo utilizza immunoadsorbimento ricombinante GR seguita da sale-stripping e di ricostituzione delle proteine complesse. L'importanza di cofattori e le condizioni di buffer sono discussi, così come le applicazioni potenziale metodo.
Abstract
Hsp90 è una proteina essenziale ed estremamente abbondante chaperone molecolare che è stato trovato per regolare più di 150 proteine eucariotiche di segnalazione, inclusi i fattori di trascrizione (es. recettori nucleari, p53) e di proteine chinasi (es. Src, Raf, Akt chinasi) coinvolto nel ciclismo cellulare, tumorigenesi, l'apoptosi, e più eucarioti 1,2 vie di segnalazione. Di questi molti 'cliente' per le proteine Hsp90, l'assemblea dei recettori steroidei • hsp90 complessi è la miglior definito (Figura 1). Vi presentiamo qui un recettore glucocorticoide adattabile (GR) immunoprecipitazione e analisi in vitro GR • hsp90 metodo di ricostituzione che possono essere facilmente utilizzati per sondare eucariotiche hsp90 attività funzionale, hsp90-mediata ligando del recettore leganti gli steroidi, e molecolari requisiti cofattore accompagnatore. Per esempio, questo test può essere usato per testare hsp90 requisiti cofattore e gli effetti dell'aggiunta di composti esogeni al processo di ricostituzione.
Il GR è un sistema particolarmente utile per lo studio hsp90 perché il recettore deve essere associata a hsp90 di avere un legame aperto ligando fessura che sia accessibile a steroidi 3. Endogeno, GR unliganded è presente nel citoplasma delle cellule di mammifero noncovalently legato a hsp90. Come si trova nel GR endogeno • hsp90 heterocomplex, il legame con il ligando GR fessura è aperta e capace di steroidi vincolanti. Se hsp90 dissocia dalla GR o se la sua funzione è inibita, il recettore non è in grado di legare steroidi e richiede la ricostituzione del GR • hsp90 heterocomplex prima di steroidi attività di legame viene ripristinato 4. GR possono essere immunoprecipitato dal citoplasma delle cellule utilizzando un anticorpo monoclonale, e proteine come hsp90 complessato al GR possono essere analizzati mediante western blot. Steroidi attività di legame della GR immunoprecipitato può essere determinato tramite l'incubazione del immunopellet con [3 H] steroidi.
Precedenti esperimenti hanno dimostrato hsp90-mediata apertura del legame con il ligando GR leporino richiede hsp70, un chaperone molecolare secondo anche essenziale per la vitalità delle cellule eucariotiche. Attività biochimica di Hsp90 e hsp70 sono catalizzate da co-chaperone Hop proteine, hsp40 e P23 5. Un macchinario chaperone multiproteici contenenti hsp90, hsp70, Hop, e hsp40 sono endogenamente presenti nel citoplasma delle cellule eucariotiche, e lisato di reticolociti fornisce una chaperone ricca fonte di proteine 6.
Nel metodo presentato, GR è immunoadsorbed dal citoplasma cellulare e spogliato della macchina endogeno chaperone hsp90/hsp70 utilizzando condizioni di sale mite. Il GR sale così estratto è poi incubato con lisato di reticolociti, ATP, e K +, che comporta la ricostituzione della GR • hsp90 heterocomplex e riattivazione di steroidi attività di legame 7. Questo metodo può essere utilizzato per verificare gli effetti di cofattori chaperone diverse, nuove proteine e sperimentali inibitori Hsp90 o GR al fine di determinare la loro importanza funzionale hsp90-mediata steroidi 8-11 vincolanti.
Protocol
Discussion
Il test di cui sopra può essere adattato per testare una miriade di malattie che interessano l'azione chaperone della macchina chaperone hsp90/hsp70-based così come vincolanti GR steroidi. Si tratta di una modifica dei metodi precedentemente segnalato 4,8,9,17 ed è progettato per sfruttare i recenti progressi nella tecnologia elettroforesi ed essere accessibili a una comunità di ricerca più ampio. Cofattori aggiuntivi o proteine di interesse possono essere aggiunti alla miscela GR • hsp90 ric…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health concedere GM086822, Hope Heart Institute di base Scienze premio, e il MJ Murdock Charitable Fiducia Science Program College di ricerca. Seleziona reagenti elettroforesi e software di analisi immagine sono stati generosamente forniti da Bio-Rad.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |
Referências
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