Biochemische Reconstitutie van Steroid Receptor • Hsp90 eiwitcomplexen en reactivering van Ligand binding
Summary
Een<em> In vitro</em> Werkwijze voor de bereiding functionele glucocorticoid receptor (GR) • hsp90 eiwitcomplexen uit gezuiverde eiwitten en cellulaire lysaten wordt beschreven. De methode maakt gebruik van immunoadsorption van recombinant GR, gevolgd door zout-strippen en eiwitcomplex reconstitutie. Het belang van co-factoren en de buffer omstandigheden worden besproken, evenals potentiële methode toepassingen.
Abstract
Hsp90 is een essentieel en zeer overvloedige moleculaire chaperonne-eiwit dat is gevonden om meer dan 150 eukaryote signaaleiwitten, waaronder transcriptie factoren (bv. nucleaire receptoren, p53) en proteïne kinases (bijv. Src, Raf, Akt kinase) die betrokken zijn in cel fietsen te reguleren, ontstaan van tumoren, apoptose, en meerdere eukaryote signaleringsroutes 1,2. Van deze vele 'klant' eiwitten voor hsp90, de assemblage van steroïde receptoren • hsp90 complexen is gedefinieerd de beste (Figuur 1). We presenteren hier een aanpasbaar glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitatie assay en in vitro GR • hsp90 reconstructie methode die gemakkelijk kunnen worden gebruikt om de eukaryote hsp90 functionele activiteit, hsp90-gemedieerde steroïde receptor ligand binding, en moleculaire chaperone cofactor eisen sonde. Bijvoorbeeld, kan deze test gebruikt worden om hsp90 cofactor eisen en de effecten van het toevoegen van exogene verbindingen aan de reconstitutie te testen.
De GR is een bijzonder handig systeem voor het bestuderen van hsp90, omdat de receptor moet worden gebonden aan hsp90 naar een open kloof ligand binding die toegankelijk is voor steroïde 3 hebben. Endogene, unliganded GR is aanwezig in het cytoplasma van zoogdiercellen niet-covalent gebonden aan hsp90. Zoals gevonden in de endogene GR • hsp90 heterocomplex, de GR gespleten ligand binding is open en in staat te binden steroïde. Als hsp90 distantieert van de GR, of als de functie wordt geremd, de receptor niet in staat is te binden steroïde en vereist reconstitutie van het GR • hsp90 heterocomplex voor steroïde-bindende activiteit wordt hersteld 4. GR kan worden immunogeprecipiteerd van cel cytosol met behulp van een monoklonaal antilichaam, en eiwitten zoals hsp90 gecomplexeerd aan de GR kan worden getest door western blot. Steroïde-bindende activiteit van de immunogeprecipiteerd GR kan worden bepaald door het incuberen van de immunopellet met [3 H] steroïde.
Eerdere experimenten hebben aangetoond hsp90-gemedieerde opening van de GR gespleten ligand binding vereist hsp70, een tweede moleculaire chaperon ook essentieel voor de eukaryote cel levensvatbaarheid. Biochemische activiteit van hsp90 en hsp70 worden gekatalyseerd door co-chaperonne-eiwitten Hop, hsp40, en P23 5. Een multiprotein chaperonne apparatuur die hsp90, hsp70, Hop, en hsp40 zijn endogeen aanwezig zijn in eukaryote cel cytoplasma, en de reticulocyten lysaat biedt een chaperonne-rijk eiwit bron 6.
In de gepresenteerde methode, is GR immunoadsorbed van cel cytosol en ontdaan van de endogene hsp90/hsp70 chaperonne machines met een milde zout omstandigheden. Het zout-gestripte GR wordt vervolgens geïncubeerd met reticulocyten lysaat, ATP, en K +, wat resulteert in de reconstructie van de GR • hsp90 heterocomplex en reactivering van steroïde-bindende activiteit 7. Deze methode kan worden gebruikt om de effecten van verschillende chaperonne co-factoren, nieuwe eiwitten, en experimentele hsp90 of GR-remmers test in om hun functionele betekenis op hsp90-gemedieerde steroïde-bindende 8-11 te bepalen.
Protocol
Discussion
De test hierboven beschreven kan worden aangepast aan een groot aantal aandoeningen van de chaperonne acties van de hsp90/hsp70-based chaperonne machines, alsook GR steroïde-bindende test. Het is een wijziging van de eerder gerapporteerde methoden 4,8,9,17 en is ontworpen om te profiteren van recente ontwikkelingen in de elektroforese-technologie en toegankelijk voor een breder onderzoek gemeenschap. Extra cofactoren of eiwitten van belang kunnen worden toegevoegd aan de GR • hsp90 heterocomplex reconstitu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health te verlenen GM086822, Hope Heart Institute Basic Sciences Award, en de MJ Murdock Charitable Trust College Science Research Program. Selecteer elektroforese reagentia en beeldanalyse-software werden genereus geleverd door Bio-Rad.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |
Referências
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptor•hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Bioquímica. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor•hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
