ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化
Summary
不定冠詞<em> in vitroで</em•HSP90蛋白質複合体蛋白質と細胞のライセートを精製から機能的なグルココルチコイド受容体（GR）を調製するための>方法が記載されている。方法は、塩ストリッパとタンパク質複合体再構成が続く組換えGRの免疫吸着を利用しています。コファクターとバッファーの条件の重要性は、潜在的なメソッドのアプリケーションなので、説明されています。
Abstract
Hsp90は、細胞周期に関与する転写因子（例えば核内受容体は、p53）およびプロテインキナーゼ（例えば、Srcの、Rafが、Aktキナーゼ）を含む150以上の真核生物のシグナル伝達タンパク質を、調節することが認可されていますが不可欠と非常に豊富な分子シャペロンタンパク質です。腫瘍形成、アポトーシス、および複数の真核生物のシグナル伝達経路の1,2。 HSP90のためのこれらの多くの"クライアント"タンパク質のうち、ステロイド受容体の組み立て•HSP90複合体（ 図1）定義されているベストです。ここでは、順応性グルココルチコイド受容体（GR）免疫沈降アッセイを提示し、容易に真核生物のHSP90の機能的活性、HSP90を介したステロイド受容体のリガンド結合、および分子シャペロンの補因子の要件を調べるために使用される体外 GR•Hsp90の再構築の方法で 。例えば、このアッセイは、Hsp90の補因子の要件と再構成のプロセスに外因性化合物を追加した場合の効果をテストするために使用できます。
受容体はステロイド3にアクセス可能なクレフトオープンリガンドの結合を持つことがHSP90にバインドする必要があるため、GRは、HSP90を研究するための特に有用なシステムとなっています。内因性、リガンド非結合GRは非共有結合的にHSP90に結合した哺乳動物細胞の細胞質に存在しています。内因性のGR•Hsp90のヘテロ複合体に見られるように、溝GRのリガンド結合は、オープンと結合ステロイドが可能です。 HSP90 GRから解離し、またはその機能が阻害されている場合、受容体はステロイド結合することができず、ステロイド結合アクティビティの前にGR•HSP90ヘテロ複合体の再構成を必要とする、4を復元している場合。 GRは、モノクローナル抗体を用いて細胞質ゾルから免疫沈降、およびウェスタンブロットによりアッセイすることができるようなHSP90のようなタンパク質は、GRに複合することができます。免疫沈降したGRのステロイド結合活性は[3 H]ステロイドでimmunopelletをインキュベートすることによって決定することができます。
以前の実験では、間隙GRのリガンド結合は、真核細胞の生存にも欠かせない第二の分子シャペロンをHSP70が必要なのHsp90 -介した開口部を示している。 HSP90とHSP70の生化学的活性はコシャペロンタンパク質のホップ、HSP40、およびp23の5によって触媒される。 HSP90、HSP70、ホップ、及びHSP40を含む多タンパク質シャペロンの機械は、真核細胞の細胞質内で内在的に存在し、網状赤血球は、シャペロンの豊富なタンパク質源6が用意されています。
提示方法では、GRは細胞質ゾルからimmunoadsorbedさとマイルドな塩条件を用いて内因性hsp90/hsp70シャペロンの機械を剥奪。塩取り除かれたGRは、網状赤血球ライセート、ATP、およびステロイド結合活性7のGR•Hsp90のヘテロ複合体と再活性化の再構成で、その結果、K +、とインキュベートされる。このメソッドは、8月11日 HSP90を介したステロイド結合にその機能的意義を判断するために、様々なシャペロン補助因子、新規タンパク質、および実験的なHSP90またはGR阻害剤の効果をテストするために利用することができます。
Protocol
Discussion
上記のアッセイは、hsp90/hsp70-basedシャペロンの機械だけでなく、GRステロイド結合のシャペロンの行動に影響を与える条件の無数をテストするために適応させることができます。それは以前に報告された方法4,8,9,17の修正であり、電気泳動技術の最近の進歩を活用し、より広い研究コミュニティにアクセスできるように設計されています。関心の追加の補助因子やタンパク質は、ステ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、健康補助金GM086822、希望心臓研究所基礎科学賞、そしてMJマードック公益信託の大学の科学研究開発プログラムの国民の協会によって資金を供給された。電気泳動の試薬を選択して、画像解析ソフトウェアは、寛大にBio – Rad社から提供されました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |
Referências
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