스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩
Summary
<em> 체외에서</em• hsp90 단백질 단지 단백질과 세포 lysates을 정화의 기능 글루코 코르티 코 이드 수용체 (GR)를 준비> 방법을 설명합니다. 방법은 소금 조직 및 단백질 복잡한 reconstitution 다음 재조합 GR의 immunoadsorption을 활용합니다. 잠재적인 방법을 응용 프로그램이 같은 cofactors와 버퍼 조건의 중요성이 논의됩니다.
Abstract
Hsp90은 세포 자전거에 관련된 전사 인자 (예 : 핵 수용체, p53의)와 단백질 kinases (예 : SRC, RAF, Akt 키나제)를 포함한 150 개 이상의 진핵세포 신호 단백질을 조절하는 것으로 판명되었습니다 순수하고 매우 풍부한 분자 보호자 역할 단백질입니다 tumorigenesis, apoptosis, 여러 진핵세포 신호 경로 1,2. hsp90 이러한 다양한 '고객'단백질의 스테로이드 수용체의 조립 • hsp90 단지는 (그림 1) 정의 가장됩니다. 우리는 여기서 적응 글루코 코르티 코 이드 수용체 (GR) immunoprecipitation 분석과 쉽게 진핵세포 hsp90 기능 활동, 바인딩 hsp90 – 중재 스테로이드 수용체 리간드 및 분자 보호자 역할 cofactor 요구 사항을 탐사하는 데 사용할 수 있습니다 체외 GR에 • hsp90 reconstitution 방법을 제시한다. 예를 들어,이 분석은 hsp90 cofactor 요구 사항 및 reconstitution 과정 외인성 화합물을 추가의 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
수용체는 스테로이드 3 액세스할 수 있습니다 분열 오픈 리간드 바인딩을 hsp90에 바인딩해야하기 때문에 GR은 hsp90를 공부에 특히 유용 시스템되었습니다. 내생, unliganded GR은 noncovalently hsp90에 바인딩 포유 동물 세포의 세포질에 존재합니다. 이름으로 내생 GR • hsp90 heterocomplex에서 발견, 갈라진 GR의 리간드 바인딩은 개방적이고 구속력 스테로이드 가능합니다. hsp90 GR에서 dissociates 또는 그 기능이 저해되면 수용체는 스테로이드 구속 수 있으며, 스테로이드 구속력이 활동을하기 전에 GR • hsp90 heterocomplex의 reconstitution을 필요로 4를 복원하는 경우. GR은 단클론 항체를 사용하여 셀 cytosol에서 immunoprecipitated, 그리고 서양 얼룩에 의해 assayed 수있는 등 hsp90와 같은 단백질은 GR에 complexed 수 있습니다. immunoprecipitated GR의 스테로이드 결합 활동은 [3 H] 스테로이드와 immunopellet을 잠복기에 의해 결정하실 수 있습니다.
이전 실험 분열 GR의 리간드 바인딩의 hsp90 – 중재 열기를 보이고있다하면 진핵 세포 생존을위한 hsp70, 두 번째 분자 보호자도 중요합니다. hsp90 및 hsp70의 생화 학적 활동이 공동 보호자 역할 단백질의 홉, hsp40, 그리고 p23 5 촉매 있습니다. hsp90, hsp70, 타, 그리고 hsp40를 포함하는 multiprotein의 보호자 기계는 진핵 세포 세포질에 endogenously 존재하고 있으며, reticulocyte lysate는 보호자 풍부한 단백질 소스 여섯를 제공합니다.
표시 방법에서 GR은 셀 cytosol에서 immunoadsorbed하고 온화한 소금 조건을 사용하여 내생 hsp90/hsp70 보호자 기계 찟겼어. 소금 막았죠 GR은 다음 GR의 reconstitution 결과 reticulocyte lysate, ATP, 그리고 K +와 incubated입니다 스테로이드 바인딩 활동 7 • hsp90 heterocomplex 및 재활 성화. 이 방법은 hsp90 – 중재 스테로이드 결합 8-11 그들의 기능 중요성을 결정하기 위해 다양한 보호자 역할 cofactors, 소설의 단백질, 그리고 실험 hsp90 또는 GR 억제제의 효과를 테스트하기 위해 이용하실 수 있습니다.
Protocol
Discussion
위에서 설명한 분석은 hsp90/hsp70-based 보호자 기계의 보호자 역할 행동뿐만 아니라, GR 스테로이드 바인딩에 영향을 미치는 조건의 수많은 테스트를 적용할 수 있습니다. 그것은 이전에 보고된 방법 4,8,9,17의 수정이며 전기 영동 기술의 최근 발전을 활용하고 광범위한 연구 커뮤니티에 액세스할 수 있도록 설계되었습니다. 관심의 추가 cofactors이나 단백질은 GR에 추가할 수 있습니다 스테로?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 부여 GM086822 호프, 심장 연구소 기초 과학 수상하고, MJ 머독 자선 신탁 대학 과학 연구 프로그램의 국립 연구소에 의해 투자되었다. 전기 영동의 시약을 선택하고 이미지 분석 소프트웨어는 넉넉한 바이오 방사선에 의해 제공되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |
Referências
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptor•hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Bioquímica. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor•hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
