Biokemiska Ombildning av steroidreceptoreffekten • Hsp90 proteinkomplex och Reaktivering av ligandbindande
Summary
En<em> In vitro</em> Metod för att bereda funktionella glukokortikoid-receptorn (GR) • hsp90 proteinkomplex från renade proteiner och cellulära lysates beskrivs. Metoden utnyttjar immunoadsorption av rekombinanta GR följt av salt-strippa och proteinkomplex beredning. Betydelsen av co-faktorerna och villkor buffert diskuteras, liksom möjliga metod applikationer.
Abstract
Hsp90 är en viktig och mycket rikligt molekylära förkläde protein som har funnit att reglera mer än 150 eukaryota signalering proteiner, inklusive transkriptionsfaktorer (t.ex. nukleära receptorer, p53) och kinaser protein (t.ex. Src, Raf, Akt kinas) som är involverade i cell cykling, Tumörgenesens, apoptos, och flera eukaryota vägar signalering 1,2. Av dessa många "kund" proteiner för hsp90 och montering av steroidreceptoreffekten • hsp90 komplex är den bästa definieras (Figur 1). Vi presenterar här en anpassningsbar glukokortikoid-receptorn (GR) immunoprecipitation analys och in vitro GR • hsp90 beredning metod som lätt kan användas för att sonden eukaryota hsp90 funktionell aktivitet, hsp90-medierad steroidreceptoreffekten ligandbindande och molekylär förkläde krav kofaktor. Till exempel kan detta test användas för att testa hsp90 kofaktor kraven och effekterna av att lägga exogena substanser till återupprättandet processen.
GR har varit ett särskilt användbart för att studera hsp90 eftersom receptorn måste vara bunden till hsp90 att ha en öppen ligandbindande klyfta som är tillgänglig för steroid 3. Endogena, unliganded GR finns i cytoplasman hos däggdjursceller noncovalently bunden till hsp90. Som finns i den endogena GR • hsp90 heterocomplex är GR ligandbindande kluven öppen och kan binda steroid. Om hsp90 dissocierar från GR eller om dess funktion hämmas, är den receptor kan binda steroid och kräver beredning av GR • hsp90 heterocomplex innan steroid bindande aktivitet återställs 4. GR kan immunoprecipitated från cell cytosolen med hjälp av en monoklonal antikropp, och proteiner som hsp90 komplexbundet till GR kan analyseras med Western blot. Steroid bindande aktivitet immunoprecipitated GR kan bestämmas genom inkubering av immunopellet med [3 H] steroid.
Tidigare försök har visat hsp90-medierade öppnandet av GR kluven ligandbindande kräver hsp70, en andra molekylär förkläde också viktigt för eukaryota cellernas livskraft. Biokemiska aktivitet hsp90 och hsp70 katalyseras av co-förkläde proteiner Hop, hsp40 och P23 5. En Multiproteinkomplex förkläde maskiner som innehåller hsp90, hsp70, Hop, och hsp40 är endogent närvarande i eukaryota cellens cytoplasma, och retikulocytantal lysat ger ett förkläde rik proteinkälla 6.
I den presenterade metoden är GR immunoadsorbed från cell cytosolen och fråntagen den endogena hsp90/hsp70 förkläde maskiner med mild salt förhållanden. Saltet-avskalade GR inkuberas sedan med retikulocyttal lysat, ATP, och K +, vilket resulterar i beredning av GR • hsp90 heterocomplex och reaktivering av steroid bindande aktivitet 7. Denna metod kan användas för att testa effekterna av olika förkläde kofaktorer, proteiner roman, och experimentella hsp90 eller GR-hämmare för att fastställa deras funktionella betydelse för hsp90-medierad steroid bindande 8-11.
Protocol
Discussion
Analysen som beskrivs ovan kan anpassas för att testa en myriad av förhållanden som påverkar förkläde agerande hsp90/hsp70-based förkläde maskiner samt GR steroid bindande. Det är en modifiering av tidigare redovisade metoder 4,8,9,17 och är utformad för att dra nytta av de senaste framstegen inom elektrofores teknik och vara tillgänglig för en bredare forskarsamhället. Ytterligare kofaktorer eller proteiner av intresse kan läggas till GR • hsp90 heterocomplex beredning blandning, som beskriv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag GM086822, Hope Heart Institute Basic Sciences utmärkelse, och MJ Murdock Charitable Trust College Science Research Program. Välj elektrofores reagenser och bildanalys programvara har generöst tillhandahållits av Bio-Rad.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |
Referências
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptor•hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Bioquímica. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor•hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
