Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı
Summary
Bir<em> In vitro</em> • hsp 90 protein kompleksleri proteinler ve hücresel lizatları saflaştırılmış fonksiyonel glukokortikoid reseptör (GR) hazırlanması için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, tuz sıyırma ve protein kompleksi sulandırıldıktan takip rekombinant GR immunoadsorption kullanır. Potansiyel yöntemi uygulamaları gibi kofaktör ve tampon koşulları önemi tartışıldı.
Abstract
Hsp90 önemli ve son derece bol moleküler şaperon protein, hücre bisiklet alan transkripsiyon faktörleri (örneğin nükleer reseptörleri, p53) ve protein kinazlar (örneğin, Src, Raf, Akt kinaz) dahil olmak üzere 150'den fazla ökaryotik sinyalizasyon proteinler, düzenleyen tespit edilmiştir. tümörogenez, apoptozis ve birden fazla ökaryotik sinyalizasyon yolları 1,2 . Hsp 90 için bu çok 'yandaş' proteinler ki, steroid reseptör montaj • hsp 90 kompleksleri (Şekil 1) en iyi tanımlanmış . Biz burada bir uyarlanabilir glukokortikoid reseptör (GR) immunoprecipitation tahlil ve ökaryotik hsp 90 fonksiyonel aktivite, bağlayıcı hsp 90-aracılı steroid reseptör ligand ve moleküler şaperon kofaktör gereksinimleri kolayca prob kullanılıyor olabilir • in vitro GR hsp 90 sulandırıldıktan yöntemi mevcut. Örneğin, bu testte hsp 90 kofaktör gereksinimleri ve eksojen bileşiklerin sulandırıldıktan süreci ekleyerek etkilerini test etmek için kullanılır.
Reseptör steroid 3 erişilebilir yarık açık bir ligand bağlanması için hsp 90 bağlı olması gerekir, çünkü GR hsp 90 eğitim için özellikle yararlı bir sistem olmuştur . Endojen, unliganded GR noncovalently hsp 90 bağlı memeli hücrelerinin sitoplazmasında bulunur. Endojen GR • hsp 90 heterocomplex bulunan yarık GR ligand bağlanması, açık ve bağlayıcı steroid yeteneğine sahip. Hsp 90 GR ayrıdır veya onun işlevini inhibe ise, alıcı, steroid bağlamak mümkün ve steroid bağlanma aktivitesi önce GR • hsp 90 heterocomplex sulandırılması gereklidir 4 geri . GR bir monoklonal antikor kullanılarak hücre sitoplazmada immunoprecipitated ve western blot ile test edilebilir gibi hsp 90 proteinler GR için complexed olabilir. [3 H] steroid immunopellet kuluçka immunoprecipitated GR Steroid bağlayıcı aktivite tespit edilebilir.
Önceki deneyler, yarık GR ligand bağlama hsp 90 aracılı açılış göstermiştir hsp70, ikinci bir moleküler şaperon ökaryotik hücre canlılığı için de gereklidir gerektirir. Hsp 90 ve hsp70 biyokimyasal faaliyet proteinler co-hastabakıcı Hop hsp40 ve P23 5 tarafından katalize. Multiprotein hastabakıcı makineleri hsp 90, hsp70, Hop, ve hsp40 içeren bir ökaryotik hücre sitoplazmasında endojen ve retikülosit lizat bir hastabakıcı zengin protein kaynağı 6 sağlar.
Sunulan yöntem, GR hücre sitoplazmada immunoadsorbed ve hafif tuzlu koşulları kullanarak endojen hsp90/hsp70 şaperon makine elimden. Tuz elimden GR GR sulandırıldıktan sonuçları retikülosit lizat, ATP ve K + ile inkübe steroid bağlanma aktivitesi 7 • hsp 90 heterocomplex ve yeniden. Bu yöntem, hsp 90-aracılı steroid bağlayıcı 8-11 fonksiyonel önemi belirlemek amacıyla çeşitli şaperon kofaktör, roman proteinleri, ve deneysel hsp 90 GR inhibitörlerinin etkilerini test etmek için kullanılabilir .
Protocol
Discussion
Yukarıda açıklanan test hsp90/hsp70-based hastabakıcı makineleri şaperon yanı sıra eylemlerin GR steroid bağlanma etkileyen şartlar sayısız test etmek için adapte edilebilir. Bu, daha önce bildirilen yöntemler 4,8,9,17 bir değişiklik ve elektroforez teknolojisi son gelişmeler yararlanmak ve daha geniş bir araştırma topluluğu erişilebilir olması için tasarlanmıştır . Ek ilgi kofaktör veya protein GR eklenebilir steroid bağlayıcı, heterocomplex protein-protein etkileşimleri ve c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe GM086822, Umut Kalp Enstitüsü Temel Bilimler ödül, ve MJ Murdock Hayırsever Güven Koleji Bilim Araştırma Programı Enstitüleri tarafından finanse edildi. Elektroforez reaktifler seçin ve görüntü analiz yazılımı, Bio-Rad tarafından cömertçe verilmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |
Referências
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptor•hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Bioquímica. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor•hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
