メソッドは、I型コラーゲンと初代ヒト線維芽細胞からなる3次元マトリックスの調製について記載されています。この器官ゲルは、それが組織の間質の基本的な機能を模倣し、顕微鏡の多くの形態が可能であるため、侵襲的な細胞遊走を評価するために有用な基質として機能します。
細胞遊走は、開発、創傷治癒、免疫系の細胞応答、腫瘍細胞の転移を含む生物学の多くの側面に基本的である。移行は、光学顕微鏡で調査に従順セルラーダイナミクスを作るためにガラスカバースリップ上に研究されてきた。しかし、これは細胞遊走の多くの側面を忠実にガラスやプラスチックなどの硬質1二次元の基板では表現されないため、その弾力性、タンパク質組成物、および細孔径など、ローカル環境の機能に依存することが明らかになってきた。さらに、間質線維芽細胞2、免疫細胞3を含む他の細胞型との相互作用は、癌細胞の浸潤を促進する上で重要な役割を果たすことが示されている。分子レベルでの調査がますます比較した場合、同一の細胞の薬物治療への反応を含む分子動力学は、大きく異なっていることが示されている<em> in vitro および in vivoの4インチ
理想的には、生体内でその天然に存在する文脈における細胞遊走を勉強するのがベストですが、これは常に可能とは限りません。そのような細胞由来マトリックス、マトリゲル、器官培養(ここで説明)組織外植片、オルガノイド、および異種移植片のような中間組織培養システムは、それゆえに重要な実験的な中間体である。これらのシステムは生体内環境でのおおよその特定の側面を、そのような安定的にトランスフェクトされた細胞株、薬物治療計画、長期的かつ高分解能イメージングの使用などの実験操作に対してより適している。このような中間システムは 、in vivo で 5イメージングを引き受ける前にプローブを検証し、イメージに細胞や蛍光レポーターの動的応答に必要なパラメータを確立するための根拠を証明として特に有用である。このように、彼らは、リヴィンの実験の必要性を低減する上で重要な役割を果たすことができるG動物。
ここでは、侵襲的な細胞遊走6-8の研究に適した3次元マトリックスの産生するための方法を提示する。行列は初代ヒト表皮繊維芽細胞によって数日間にわたって契約しているコラーゲンタイプ1線維で構成されています。コラーゲンは、ポリペプチドの両端に反応性を保持し、バッファー条件9を中和する際に大きな凝集体にコラーゲン線維の架橋を促進する酸抽出ではなく、酵素消化することにより調製される。より密接に、生体内でのコラーゲンの機能を模倣し、ゲル中で培養した細胞の浸潤特性にとって重要な意味を持って再構成し、ゲル中のこの結果。コラーゲンの架橋は、若い動物ではより不安定であるので、それが新鮮または凍結出発物質が使用されているかどうかは重要ですが、思春期のラットの尾を使用しないことが重要です。若い動物からコラーゲンIはw従って抽出することが容易であり、再構成i番目に高い忠実度。
コラーゲンマトリックスを固定し、染色し浸潤性腫瘍細胞又は間質線維芽細胞2,10のいずれかに対して向けられた抗体を用いて5,6および浸潤を抑制する可能性がある薬剤の有効性をテストするために非常に有用であることができます。
このプロトコルは、初代ヒト皮膚線維芽細胞の使用を示唆しているが、それは調査対象組織の種類に応じて、他の組織型からプライマリー繊維芽細胞を使用することが可能である。それが安定して蛍光タンパク質複合体でトランスフェクトされた細胞を含む不死化線維芽細胞を用いて、文化を確立することも可能です。このように両方のストローマ細胞と腫瘍細胞が浸潤11時の細胞間相互作用を可視化するためにラベルを付けることができます。
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
10x MEM | Gibco | 21430 | – |
NaOH | Sigma | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
FCS | PAA Laboratories | A15-101 | – |
35 mm dishes | Falcon | 353001 | For step 3.4 |
60 mm dishes | Falcon | 353004 | For step 5.2 |
Spring forceps blunt | Samco | E003/02 | Toothed, not smooth |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 – 14 kD |
PBS | Oxoid | BR0014G | – |
Acetic Acid | Sigma | 242853 | – |
24 well dish | Falcon | 353047 | For step 4.1 |
Fungizone | In vitrogen | 15290018 | – |