É descrito um método para a preparação de uma matriz de 3-dimensional constituído por colagénio do tipo I e fibroblastos humanos primários. Este gel organotípica serve como um substrato útil para avaliar a migração celular invasiva porque imita características básicas de estroma de tecido e é susceptível de muitas formas de microscopia.
A migração celular é essencial para muitos aspectos da biologia, incluindo o desenvolvimento de cicatrização de feridas, as respostas celulares do sistema imunitário, e as metástases de células tumorais. A migração tem sido estudada em lamelas de vidro, a fim de tornar a dinâmica celular passíveis de investigação por microscopia de luz. No entanto, tornou-se evidente que muitos aspectos da migração de células dependem de características do ambiente local, incluindo a sua elasticidade, a composição de proteína, e do tamanho dos poros, o que não é fielmente representado por dois substratos rígidos dimensionais, tais como vidro e de plástico 1. Além disso, a interacção com outros tipos celulares, incluindo fibroblastos do estroma 2 e 3, as células do sistema imunológico foi demonstrado desempenhar um papel importante na promoção da invasão das células cancerosas. Investigação ao nível molecular tem cada vez demonstrado que a dinâmica molecular, incluindo a resposta ao tratamento com droga, de células idênticas são significativamente diferentes quando comparados <em> In vitro e in vivo 4.
Idealmente, seria melhor para estudar a migração de células em seu contexto que ocorre naturalmente em organismos vivos, no entanto isso não é sempre possível. Sistemas de tecidos intermédios de cultura, tais como a matriz de células derivada, matrigel, cultura organotípica (descrito aqui) de explantes de tecidos, Organóides, e xenoenxertos, são, portanto, importantes intermediários experimentais. Estes sistemas aproximados determinados aspectos de um ambiente de vivo, mas são mais passíveis de manipulação experimental, tais como o uso de linhas de células transfectadas estavelmente, regimes de tratamento de drogas, a longo prazo e de alta resolução de imagem. Tais sistemas intermediários são especialmente úteis como provar motivos para validar sondas e estabelecer parâmetros necessários para a imagem da resposta dinâmica de células e repórteres fluorescentes antes de realizar imagens in vivo 5. Como tal, eles podem desempenhar um papel importante na redução da necessidade de experiências com o livinanimais g.
Apresentamos aqui um método para a produção de uma matriz de 3-dimensional adequada para estudos de migração celular invasiva 6-8. A matriz é constituída por colagénio tipo 1 fibrilhas, que são contraídas ao longo de um período de vários dias, por fibroblastos humanos primários epidérmicos. O colagénio é obtido por extracção de ácido, não digestão enzimática, o que preserva a reactividade nas extremidades poli-peptídicas e promove a reticulação das fibras de colagénio em agregados maiores mediante neutralização das condições do tampão 9. Isso resulta em um gel reconstituído que mais de perto imita as características de colagénio in vivo e tem consequências importantes para as propriedades invasivas das células cultivadas nos géis. Não importa se fresco ou congelado material de partida é utilizado, mas a utilização de caudas de rato adolescentes é importante porque a ligação cruzada do colagénio é mais lábil em animais jovens. Colágeno I de animais mais jovens é, portanto, mais fácil de extrair e re-constitui wom maior fidelidade.
A matriz de colagénio pode ser fixadas e coradas com anticorpos dirigidos contra as células tumorais, quer invasivos ou fibroblastos estromais 2,10 e são altamente úteis para testar a eficácia de fármacos que possam inibir a invasão 5,6.
Embora este protocolo sugere a utilização de primários de fibroblastos de pele humana, é viável utilizar fibroblastos primários do outros tipos de tecidos, de acordo com o tipo de tecido sob investigação. Também é possível estabelecer culturas de fibroblastos imortalizados utilizando, incluindo as células que foram transfectadas estavelmente com conjugados de proteínas fluorescentes. Desta forma, ambas as células estromais e de tumor podem ser rotulados de visualizar as interacções célula-célula durante a invasão 11.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
10x MEM | Gibco | 21430 | – |
NaOH | Sigma | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
FCS | PAA Laboratories | A15-101 | – |
35 mm dishes | Falcon | 353001 | For step 3.4 |
60 mm dishes | Falcon | 353004 | For step 5.2 |
Spring forceps blunt | Samco | E003/02 | Toothed, not smooth |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 – 14 kD |
PBS | Oxoid | BR0014G | – |
Acetic Acid | Sigma | 242853 | – |
24 well dish | Falcon | 353047 | For step 4.1 |
Fungizone | In vitrogen | 15290018 | – |