Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike
Summary
Die dendritischen Verzweigung sensorischen Neuronen des<em> Drosophila</em> Larven des peripheren Nervensystems sind nützliche Modelle, um sowohl allgemeine als auch Neuron-Klasse-spezifische Mechanismen der neuronalen Differenzierung aufzuklären. Wir präsentieren eine praktische Anleitung zur Generierung und Analyse dendritischer Verzweigung Neuron genetischen Mosaiken.
Abstract
Entwicklung des Nervensystems erfordert die korrekte Spezifikation der Neuron Position und Identität, durch genaue Neuron-Klasse-spezifische dendritische Entwicklung und axonalen Verdrahtung gefolgt. Vor kurzem hat die dendritische Verzweigung (DA) sensorischen Neuronen der Drosophila Larve peripheren Nervensystem (PNS) haben sich leistungsfähige genetische Modelle, in denen sowohl allgemeine und Klassen-spezifische Mechanismen der neuronalen Differenzierung aufzuklären. Es gibt vier Haupt-DA Neuron Klassen (I-IV) 1. Sie sind in der Reihenfolge zunehmender Dendriten Laube Komplexität, benannt und haben klassenspezifische Unterschiede in der genetischen Kontrolle ihrer Differenzierung 2-10. Die DA sensorischen Systems ist ein praktisches Modell, um die molekularen Mechanismen hinter der Kontrolle von dendritischen Morphologie 11-13 zu untersuchen, weil: 1) es Vorteile der leistungsstarken genetischen Werkzeuge in der Fruchtfliege, 2) nehmen die DA Neuron Dendriten Laube breitet sich aus in nur 2 Dimensionen unter einem optisch clear Larvencuticula macht es einfach, mit hoher Auflösung in vivo, 3 Visualisierung) der Klasse-spezifische Vielfalt in dendritische Morphologie erleichtert eine vergleichende Analyse zu den wichtigsten Elementen der Kontrolle der Bildung von einfachen vs stark verzweigte dendritische Bäume zu finden, und 4) dendritischen Dorn stereotypen Formen der verschiedenen DA Neuronen zu erleichtern morphometrische statistischen Analysen.
DA Neuronen-Aktivität modifiziert die Ausgabe eines larvalen Fortbewegung central pattern generator 14-16. Die verschiedenen DA Neuron Klassen haben verschiedene sensorische Modalitäten und deren Aktivierung auslöst verschiedenen Verhaltensreaktionen 14,16-20. Außerdem verschiedene Klassen schicken axonalen Projektionen stereotyp in die Drosophila Larve des zentralen Nervensystems in der Bauchmark (VNC) 21. Diese Projektionen enden mit topographischen Darstellungen beider DA Neuron Sinnesmodalität und die Position in der Körperwand der dendritischen Bereich 7,22, 23. Daher Untersuchung von DA axonalen Projektionen können verwendet werden, um Mechanismen, die topographische Kartierung 7,22,23, sowie die Verkabelung einer einfachen Schaltung modulierenden Larven Fortbewegung 14-17 aufzuklären.
Wir stellen Ihnen hier eine praktische Anleitung zur Generierung und Analyse genetischer Mosaike 24 Kennzeichnung DA Neuronen über MARCM (Mosaic Analyse mit einem reprimierbaren Zell Marker) 1,10,25 und Flp-out 22,26,27 Techniken (zusammengefasst in Abb. 1)..
Protocol
Discussion
Die Drosophila Larve DA Neuronenmodell liefert eine hervorragende genetische System von Mechanismen zu untersuchen, dass die Kontrolle Neuron Morphologie und Schaltung Bildung. MARCM ist in der Regel für die Kennzeichnung und zur Erzeugung von Mutanten DA Neuron Klone verwendet. Für MARCM wir verwenden entweder eine pan-neuronalen (zB Gal4 C155) oder DA Neuronen-spezifische Treiber. Mit einem pan-neuronaler Fahrer ist es möglich, direkt zu verwenden mehrere Bestände weit aus öff…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken RIKEN für die Finanzierung. Wir danken auch Cagri Yalgin, Caroline Delandre und Jay Parrish für Diskussionen über genetische und Immunhistochemie-Protokollen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | FST | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
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