Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici
Summary
I neuroni sensoriali arborizzazione dendritica del<em> Drosophila</em> Larvale sistema nervoso periferico sono modelli utili per chiarire sia generale e classe di neuroni specifici meccanismi di differenziazione dei neuroni. Vi presentiamo una guida pratica per generare e analizzare arborizzazione dendritica dei neuroni mosaici genetici.
Abstract
Sviluppo del sistema nervoso richiede la corretta specificazione della posizione dei neuroni e l'identità, seguita da accurate neurone classe specifico per lo sviluppo dendritiche e cablaggio assonale. Recentemente l'arborizzazione dendritica (DA) neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico Drosophila larvale (PNS) sono diventati potenti modelli genetici in cui per chiarire sia i meccanismi generali e specifiche della classe di differenziazione dei neuroni. Ci sono quattro principali classi di neuroni DA (I-IV) 1. Essi sono chiamati in ordine crescente di complessità dendrite pergolato, e sono specifiche della classe differenze nel controllo genetico della loro differenziazione 2-10. Il sistema DA sensoriale è un modello pratico per studiare i meccanismi molecolari alla base il controllo della morfologia dendritica 11-13 perché: 1) si può usufruire di potenti strumenti genetici disponibili nel moscerino della frutta, 2) il procuratore neurone dendrite pergolato si estende in soli 2 dimensioni sotto un ottica CLEar cuticola larvale che la rende facile la visualizzazione ad alta risoluzione in vivo, 3) la classe-specifica diversità nella morfologia dendritica facilita un'analisi comparativa per trovare elementi chiave Controllando la formazione di alberi dendritici semplici vs altamente ramificata, e 4) dendritiche pergolato stereotipata forme differenti di neuroni DA facilitare morfometriche analisi statistiche.
DA l'attività dei neuroni modifica l'uscita di un generatore di pattern locomozione larvale centrale 14-16. Le diverse classi di neuroni DA sono distinte modalità sensoriali, e la loro attivazione provoca diverse risposte comportamentali 14,16-20. Inoltre, diverse classi di inviare proiezioni stereotipo assonale nel sistema nervoso centrale Drosophila larvale nel cordone nervoso ventrale (VNC) 21. Queste proiezioni terminare con le rappresentazioni topografiche di entrambe le modalità DA neuroni sensoriali e la posizione nella parete del corpo del campo dendritiche 7,22, 23. Quindi l'esame di proiezioni DA assonale può essere usata per chiarire i meccanismi alla base mappatura topografica 7,22,23, così come il cablaggio di un semplice locomozione larvale circuito modulante 14-17.
Vi presentiamo qui una guida pratica per generare e analizzare i mosaici genetici 24 neuroni DA marcatura tramite MARCM (Analisi Mosaico con un marcatore cellulare reprimibile) 1,10,25 e Flp-out 22,26,27 tecniche (riassunti nella fig. 1).
Protocol
Discussion
La Drosophila larvale DA modello neurone fornisce un ottimo sistema per investigare i meccanismi genetici che controllano la morfologia dei neuroni e la formazione di circuito. MARCM è generalmente utilizzato per l'etichettatura e per la generazione di mutanti DA cloni neurone. Per MARCM abbiamo utilizzare un pan-neurale (es. GAL4 C155) o DA neurone specifico driver. Utilizzando un pan-neurali del driver è possibile usare direttamente diversi stock ampiamente disponibili presso…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano RIKEN per il finanziamento. Ringraziamo anche Cagri Yalgin, Caroline Delandre, e Jay Parrish per le discussioni sui protocolli di genetica e di immunoistochimica.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | FST | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
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