Summary
Burada elektrofizyoloji ve Ca2 + görüntüleme için uygun agar-gömülü retina dilim hazırlanması için bir protokol. Bu yöntem, tek presinaptik sinir uçları doğrudan patch-klemp kayıtları kullanarak retina mikrodevreler şerit-tip sinaps bir çalışma sağlar.
Abstract
Görsel uyaranlar, gözdeki uzman nöronların ışık yoğunluğu ve frekans değişimleri, geniş bir dinamik aralık üzerinden tespit edilir ve iletilir. Retina nöronlar, fotoreseptör ve bipolar hücreleri iki sınıf, uzun süreler boyunca sürekli ve yüksek verimli nörotransmitter sürümü sağlayan şerit tip aktif bölgeleri, kullanarak gerçekleştirmek. Goldfish retina ışık uyaranlara depolarize ve karma çubuk ve koni fotoreseptör giriş ON-tipi karma bipolar hücre (Mb) terminalleri, büyük boyutları nedeniyle her iki şerit tip sinaps (~ 10-12 çalışma için uygundur mikron çaplı) ve amacrine hücre dendritler ile çok sayıda yanal ve karşılıklı sinaptik bağlantıları. Goldfish yama klemp tekniği ile retina dilim Mb bipolar hücre terminalleri doğrudan erişim presinaptik Ca 2 ölçümünü sağlar + akımları, membran kapasitans değişiklikleri ve GABA aracılı karşılıklı sinaptik geribildirimle engelleme <alt> A ve GABA C reseptörleri terminallerinde dile getirdi. Ekzositoz presinaptik membran kapasitans ölçümleri bir eksitatör nörotransmitter sürümü 14,15 kısa vadeli plastisite çalışma izin verir. Buna ek olarak, kısa vadeli ve uzun vadeli plastisite amacrine hücrelerinden inhibitör nörotransmitter salınımı Mb terminali 21 gelen karşılıklı geribildirimle engelleme kayıtları incelenmiştir. Amacrine hücreleri GABAerjik karşılıklı geribildirimle engelleme süresi (örneğin ~ 10 sn) kısa süre içinde, GABA vezikül havuzu tükenmesi 11 ile eşleştirilmiş nabız depresyon uğrar. Retinanın iç pleksiform tabakası retina mikrodevreler sinaptik dinamikleri dolayısıyla doğrudan incelenebilir.
Beyin-dilim tekniği, 40 yılı aşkın önce tanıtıldı ama hala çok nöronların elektriksel özellikleri, hem tek hücreli soma, tek dendrit ve akson soruşturma için yararlı ve microcircuit sinaptik düzeyde 19. Doğrudan dilimleme odasının üzerine yapıştırılmış olması çok küçük dokular genellikle ilk agar gömülü (ya da bir filtre kağıdı yerleştirilir) ve sonra 20, 23, 18, 9 dilimlenmiş. Bu video, goldfish retina kullanarak ön gömme agar tekniği kullanmaktayız. Bazı goldfish retinanın dilim dev bipolar hücre terminalleri dilimleme işlemi sırasında axotomized (akson-cut). Bu axotomized terminallerinden kayıt soma-dendritik bölmesi sinyalleri hariç tutması nedeniyle, tek presinaptik sinir terminal girişleri izole etmek için izin verir. Alternatif olarak, bir de dilimleme işlemi sırasında kesilmiş aksonların bağlı terminallerinden kaydederek, sağlam Mb bipolar hücrelerin kaydedebilirsiniz. Genel olarak, bu deneysel protokol kullanımı sinaptik fizyolojisi, retina mikrodevreler fonksiyonel analiz, ve şerit sinaps sinaptik iletim çalışmaları yardımcı olacaktır.
Protocol
1. Dış ve iç Çözümler
- Dilimleme çözümü (düşük kalsiyum), 10x stok solüsyonu hazırlayın ve MgCl 2, CaCl 2 ve D-glukoz, günlük ekleyin . 119 NaCl, 2.5 KCl, 3.2 MgCl 2, 0.25 CaCl 2, 12 D-glukoz, 0.2 L-askorbik asit, 12 Hepes: son 1x çözüm (mM) oluşur. PH 7.4 (NaOH) ayarlayın ve 260 mOsm (H 2 O ve 10x stok solüsyonu kullanarak) ozmolarite ayarlamak.
- % 3 düşük sıcaklık jelleşme agar tartılır (Agaroz tip VII-A, A0701, Sigma; Rieke, 2001) ve çözüm dilimleme ile karıştırın. Agar içeren çözüm, 1-2 dakika için mikrodalga ısıtın veya tamamen eriyene kadar, bir su banyosunda (30-33 ° C) ve hızlı katılaşma (jel geçiş sıcaklığı önlemek için agar inkübe: 26 ± 2 ° C).
- 10x stok solüsyonu hazırlayın ve kayıt çözümü (normal kalsiyum) MgCl 2, CaCl 2 ve D-glukoz, günlük ekleyin. Son 1x çözüm consists (mm): 100 NaCl, 2.5 KCl, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 0.2 L-askorbik asit, 2.5 CaCl 2, 12 D-glukoz. % 95 çözüm köpürme sonra 5-10 dakika O 2 /% 5 CO 2 (carbogen), 7.4 (NaOH), pH ve 260 mOsm (H 2 O ve 10x stok solüsyonu kullanarak) ozmolarite ayarlayabilirsiniz .
- Iç pipet çözümleri aynı hacimde (1 ml), önceden hazırlanmış ve derin dondurucuda (-20 ° C) saklanır. İki dahili pipet çözümleri genellikle bipolar hücre kalsiyum akımları (mM) izole etmek için kullanılır:
- 40 CSCL, 60 Cs-glukonat, 10 tetraethylammonium (TİM)-Cl, 28 Hepes, 3 Mg-ATP, 1 Na-GTP, ve 2 EGTA. PH 7.2 (CsOH) ayarlayın ve ozmolarite 250 mOsm ayarlayın. Bu yüksek klorür iç çözüm genellikle -60 mV iki kutuplu bir hücre istirahat membran potansiyeli, düşük seri direnç kayıtları (iyi gerilim kelepçe koşulları) ve daha büyük inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs) sağlar.
- 95 Cs-glukonat, 10 ÇAY-Cl, 25 Hepes, 3, Na-GTP Mg-ATP, 0.5, ve 0.5 EGTA. PH 7.2 (CsOH) ayarlayın ve ozmolarite mOsm 22 250 ayarlayın. Bu düşük EGTA iç çözüm genellikle yüksek membran kapasitans değişiklikleri adım bakliyat depolarizan tarafından ortaya çıkarılan yol açar ve böylece vezikül havuz tükenmesi ve kısa vadeli depresyon çalışmaları sağlar.
2. Patch-klemp pipet elektrotlar
- Hazırlayın kalın duvarlı (1,5 mm dış çaplı) borosilikat cam (1B150F-4; Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL) ve dikey bir çektirmenin (Narishige, PP830, Tokyo, Japonya) kullanılarak yama pipetler çekin. Open-tip kayıt çözümleri yama pipet dirençleri iç pipet çözüm # 1 pipet ile dolu iken 7-8 M.
- Ceket ucu diş balmumu ile pipetle sahibi, (Cavex, West Chester, PA) ulaşan mil düzeyine eşit patch-pipet,. Bu pipet kapasitans ve elektriksel gürültü en aza indirmek ve sağlayacakdaha doğru ve düşük gürültü kapasitans ölçümleri. Düşük bir pipet kapasitans da elektronik EPC-9 (veya EPC-10) yama kelepçe amplifikatör C-fast (hızlı kapasitans) tazminat yardımcı olur.
3. Agar gömülü retina dilimleri Hazırlanması
- 30 dakika karanlık adaptasyonu için karanlık bir odada kapalı bir kova ve yeri; bir akvaryum balığı (8-16 cm Carassius auratus) seçin. Anestezi sonra, hızlı dekapitasyon ve omurilik ve beyin sapı çift pithing sedatize goldfish euthanize. Sonra gözlerini, kavisli ucu makas ve kıvrık ucu cımbız ile çıkarın. Bu prosedürler Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
- Her bir gözün etrafında eşit olarak göz önünde yaylı makas (15.003-08, Güzel Bilim Araçları; makas ipuçları batırılarak kesilmiş başlatmak) ile keserek Hemisect ve soğutulmuş dilim çözümü (düşük kalsiyum) GÖZ KAPAKLARI. Eğer necessary, cımbız (objektif genellikle gözün ön ayırmak) ile objektif çıkarın. Retina pigment epiteli ile tam 360 ° etrafında yavaş yavaş ilerleyen retina Göz yuvası uzak kabuğu, 45 ° açılı ucu ince forseps bir çift (11.251-35, Güzel Bilimi Araçları) kullanarak bağlı çıkarın. Sever ya da ince forseps veya yaylı makas ya da optik sinir kesmek. Modifiye Pasteur pipeti veya transfer pipet (büyük uç) uygulanan açılı ince uçlu forseps ve emme kombinasyonu ile retinanın hafifçe kaldırın. Açılı ince ucu forseps, retina bağlı pigment epiteli kalan kaldırmak için kullanın. Temizlenmeli ve sağlıklı retina yüzeyinde, koyu renkli, yumuşak ve kırmızı renkli görünmelidir. Tüm koyu renkli pigment epitel hücreleri tam olarak temizlenmesi için 1 saat (8, 1992), retina karanlık uyum.
- 15-30 dakika oda sıcaklığında (H6254, Sigma 3) hiyalüronidaz; ~% 0.03 (~ 0.36 mg / ml 1x dilim çözüm ağırlık / hacim) ile izole retina davranınvitreus mizah kaldırmak için sıcaklık (20-23 ° C). Bu kuluçka sırasında, buz gibi bir dilim solüsyon hazırlanır.
- Jilet bağlı küçük bir kesimi (Personna, çift kenarlı,% 70 etanol ve H 2 O ile temizlenmelidir) ile kavisli kenarları kaldırarak retinanın dikdörtgen bir parça (yaklaşık 2x2 mm, retinanın tam kalınlığı içeren) Kes 1 ml plastik şırınga gövdesi ve retina parça agar solüsyonu ((1.2) hazırlanan) ile doldurulmuş küçük bir konteyner aktarma. Sıvı agar yerleştirilir olarak retinanın etrafında çözüm miktarını en aza indirmek için deneyin. Buz dilim solüsyonu (3.3) hazırlanan doğrudan agar 20, 18, 9 katılaşmaya bırakın. Biz, el yapımı küçük bir kap kullanın. Kısaca, her iki ucunda küçük bir silindirik tüp (Fisherbrand, polietilen numune şişeleri tüm 2,5 ml, 03-338-1B) kesilmiş ve Parafilm (PM-996, Pechiney Plastik Ambalaj) yamaları ile mühürlü.
- 1 içine katı agar bloğu kesinretinanın dikdörtgen bir parça içeren x1x1 cm küp.
- Blok, dilim odası ve dilimleme plaka yüzeyine yapıştırıcı aktarın. Dilim haznesi derin dondurucuda (-20 ° C) ön-soğutulur. Blok buz dilim çözüm Vibratome dilimleme makinesi (VT1000S veya VT 1200S, Leica) kullanarak 200-250 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin. Yaklaşık 5 - 6 saat boyunca canlı olduğu, toplam 5 to10 dilimleri elde edilebilir.
- Kayıt odasına bir dilim aktarın. , U-şekilli bir platin çerçeve 19 dilim üstüne yapıştırılmış naylon konuları bir ızgara yerleştirin ve% 95 O 2 /% 5 CO 2 (carbogen kabarmış kayıt çözümü ile sürekli serpmek (dakikada 1-2 ml oranı) .)
Sorun Giderme:
Agar bloğu içinde gömülü retina parça dilimleme sırasında müstakil veya agar gelir ise, bir 20 mm artışlarla 300 mm kesit kalınlığı 200 mikron artırabilir. Ayrıca ekstra bir çözüm haddelenmiş "Kimwipe" kağıt ucu emme sıvı agar içine aktarılır ve yerleştirilir olarak retinanın etrafında çözüm miktarını en aza indirmeye çalışın. Bu sorunu önlemek için başka bir yol, başlangıçta agar yerleştirilir retina parçanın boyutunu azaltmak için. Vitreus mizah tamamen retina parça takılarak agar yasaklar nedeniyle, taze hiyalüronidaz yapmak veya inkübasyon süresi (adım (3.3)) ayarlamak için gerekli olabilir.
4. Retina dilim bipolar hücre sinaptik terminal belirlenmesi
- Dik bir mikroskop altında (örneğin BX51WI, Olympus) retina dilim yerleştirin. Biz bir 60x su daldırma hedefi (NA 0.90, Olympus) ve CCD kamera (XC-75, Sony) ile kızılötesi diferansiyel interferans kontrast (IR-DIC) optik ile retina dilim görüntüleyebilirsiniz. CCD kamera çıkışı, analog bir Sony 13 "yazi çıkarmak görselleştirme önce kontrast için bir kamera denetleyicisi (C2400, Hamamatsu) gönderilirk ve beyaz monitör. Mikroskop XY çeviri sahnede monte edilir ve sabit bir sahne 14 kayıt odasına yerleştirilir.
- Boyut, şekil ve pozisyon dilim (Şekil 1) ile tespit edilebilir ya sağlam ve axotomized (akson-cut) bipolar hücre terminalleri, bulun. Axotomized ve sağlam terminalleri de kapasitif geçici akım çürüme kez sınavı (Tek üstel karşı çift üstel bozunur, sırasıyla) ve Ca 2 ile ayırt edilebilmektedir + akımları (Şekil 2, 12, 14, 15). Goldfish retinanın iç pleksiform tabakası; Mb terminalleri, en proksimal sublamina b katman (ganglion hücre tabakası bitişik ON-tipi katman) bulunmaktadır. Mb terminalleri, mat yüzey ve düz bir görünüm ile ganglion ve faz-parlak ve küresel görünür yerinden amacrine somas kolayca ayırt edilebilir. Ayrıca, kenar Mb terminalleri yüksek kaplıdırsinaptik temasların yoğunluğu, ganglion ve amacrine hücreleri (Şekil 1a-c) pürüzsüz, temiz yüzeyler ile kıyaslandığında, kaba ve düzensiz görünür . Axotomized Mb terminalleri, sağlam terminalleri genellikle retinanın iç nükleer tabaka (Şekil 1a, b) doğru işaret eden bir sıkışmak sonunda, eliptik ve gergin görünen, yuvarlak ve yakın dairesel (Şekil 1c) görünür .
- Hasarlı veya sağlıksız terminaller genellikle şişmiş göz ve yüzey üzerinde birkaç küçük taneli yapılar gösterilecek. Bu terminaller üzerinde bir GΩ mühür elde etmek mümkün olabilir, ama onlar kısa bir süre sonra break-rüptüre muhtemeldir. Sağlıksız terminalleri Diğer belirtileri içi boş bir görünüm, kontrast ve / veya çevreleyen dilim dilim yüzeyinde yer ve bazen aynı parlaklık içerir. (Zarf ve aynı zamanda dilim yüzeyine yakın: her iki dilim derin sağlıklı terminalleri (sinaptik devresi avantajı daha sağlam) kayıt mümkünantage: dış çözüm perfüze ilaçlara daha hızlı erişim; kapatmak için daha kolay).
5. Elektrofizyolojik kayıtları ve Ca 2 + görüntüleme
- 0.2 mikron filtre ucu (Nalgene) olan bir şırınga yardımıyla, cam yama pipet pipet arka düzeyi 1-2 santimetre iç çözümü ile doldurun. Ucundan hava kabarcıklarını çıkardıktan sonra, tutucu pipet güvenli, pozitif basınç (1.2-1.6 psi) uygulamak ve bir micromanipulator kullanarak hedeflenen terminal (MPC-200, Sutter Enstrüman) doğru hareket ettirin. Dilim ile ucu aşağı doğru hareket ederken, pipet ucu ile birlikte çekilmiş dilim olmadığından emin olmak için, lateral süpürme yönde hareket ettirin.
- Membran yüzeyini temizlemek için terminal çevresinde pipet hareket ettirin. (Girinti) bir çukur oluşturmak ve pozitif basıncı serbest bırakmak için terminal kenarında ucu aşağı doğru itin. GΩ mühür hemen formu yoksa, hafif negatif basınç uygulanır. GΩ mühür sonra, EPC-9 yama kelepçe amplifikatör-hücreli kayıt moduna geçmek ve -60 veya -70 mV tutarak potansiyel bir değişikliği. C-fast (hızlı-kapasitans) düzeltme uygulayın, 5-10 GΩ arasındaki stabilize etmek için ağız yoluyla uygulanan tam hücreli kayıt yapılandırmasını kurmak için keskin, nazik vakum membran mühür için bekleyin ve daha sonra yırtılır. Tam hücreli yapılandırma düzgün bir şekilde kurulmuşsa, seri direnci M 14-30 arasında olacaktır. Giriş direnci sağlam terminalleri ve 1-3 GΩ axotomized terminalleri için 14 M 200-500 olacaktır.
- Sağlam ve axotomized bipolar hücre terminalleri arasında ayırt etmek için, (Şekil 2a ve 2c) kapasitif akım geçici uyun. Sırasıyla bazal membran, 9-16 pF kapasitans ve 3-8 pF, sağlam ve axotomized Mb terminalleri var.
- -70 0 mV axotomized Mb terminali için 200 ms süresi voltaj-klemp adım uygulayın. Bu izin verecekbüyük (~ 200-600 pA), izole içe Ca 2 + L-tipi voltaj bağımlı Ca 2 açarak aktive akımları + kanalları (Şekil 2b) doğrudan ölçümü. Buna paralel olarak, bir kapasitans atlama ve sinaptik veziküllerin ekzositoz neden Ca 2 hızlı, pH-aracılı inhibisyonu + Akım ekzositoz 15 aşağıda ve GABAerjik karşılıklı geribildirim inhibisyonu (Şekil 3c; 22) izlemek mümkün. Eğer bir yamaları sağlam bir Mb bipolar hücre terminali sonucunda Şekil 2c ve 2d gösterilecektir. Hiç ayırt Ca 2 + akımları nedeniyle Mb bipolar hücrelerin 1 dendritler boşluk kavşak kaplin nedeniyle büyük bir "kaçak" akımlar gözlenir .
- Membran kapasitans değişiklikler, zamana bağımlı membran kapasitans ölçümleri 6 "sinüs + DC" yöntemini kullanarak tutma potansiyeli -70 mV 0 mV bir adım depolarizasyon tarafından uyarılmış olabilir. Membran kapasitans atlar, plazma zarı ile sinaptik veziküllerin füzyon göstermektedir. 2 kHz sinüzoidal gerilim-kelepçe (30 mV tepe-tepe) komutunu tutma potansiyeli -70 mV eklendi. Kayıt akımı EPC-9 patch-klemp amplifikatör yazılım emülasyonu iki dik faz açıları analiz edildi, bir kilit-amplifikatör (Heka, Lambrecht, Almanya). Şekil 2d, yüksek frekanslı sinüzoidal uyaran sınırları (2 kHz), bazal kapasitans Cm olan terminal uçlarının ve akson, ~ 6.8 pF analiz membran kapasitans sağlam terminal . Hücre gövdesi ve bipolar hücre dendritler membran böylece yüksek frekanslı voltaj kelepçe sinüs 13 tarafından filtre edilir.
- (;) O-6806, Invitrogen örneğin Oregon Green 488 BAPTA-1 (100-200 mcM) ve protokol tekrar Ca 2 + görüntüleme deneyleri, Ca 2 + duyarlı floresan boya ile iyice karıştırın iç yama pipet çözüm 50,1-5,5. Bu bir floresan görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt birleştirmek için izin verecektir. Örneğin, bu görüntü Ca 2 + -70 Mb terminali (Şekil 3a, b) küçük telodendria uzantıları 0 mV 200 ms adım ile geçici ilişkili mümkündür. Biz bizim dik mikroskop dönen bir disk lazer konfokal mikroskop sistemi (CSU-X1, Yokogawa) ile entegre edilmiştir. Konfokal mikroskop 488 nm ve 561 nm lazer çizgileri acousto optik ayarlanabilir bir filtre tarafından modüle kullanır. Veri Slidebook yazılımı (Akıllı Görüntüleme Aletleri 3i) kullanılarak elde edilir. Goldfish retinal nöronların kullanarak kalsiyum görüntüleme teknikleri hakkında daha fazla bilgi, 24, 17, 3 için bkz .
Sorun Giderme:
Bir tam hücreli bir yapılandırma kurmak için sık sık başarısız olursa, istikrarlı bir GΩ mühür oluşumundan sonra bile, terminal ponksiyon beni kullanılan negatif basıncı azaltmak için faydalı olabilirmbrane. Aynı zamanda, tüm hücre yapılandırma kurulması için en uygun emme basıncı membran eğrilik (soma> terminal) bir fonksiyonu olarak değişir bu durumda olabilir. Tam hücreli bir yapılandırma girmek, tek başına ya da kombinasyon halinde negatif basınç keskin bir darbesi ile bir zap protokolü (100 s: 400 mV, Süre Genlik) kullanmak da mümkündür. Biz M 12 aşan bir banyo direnci ile bir pipet kullanarak break-özellikle yararlı olabilmesi için zap protokol bulduk.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 goldfish retina dilim Mb bipolar hücre terminalleri tanımlanması. (AA) IR-DIC Mb bipolar hücre terminalleri görüntüler. IR-DIC görüntü muhtemelen axotomized (akson-cut) ve bozulmamış terminaller saptayabilirsiniz. C gösterildiği gibi bir axotomized terminali, yuvarlak ve dairesel görünürsağlam bir terminal oval görünmesini daha muhtemel iken, a ve b olarak gösterilir. Bu sınıflandırma, geçici kapasitans ölçümü (bkz. Şekil 2) veya boya dolgu yöntemi (d - f) tarafından teyit edilebilir . Kırmızı oklar, a ve b, sağlam terminalleri için akson ve akson terminali arasındaki kesişme yerini gösterdi. Kırmızı noktalı çizgi Mb bipolar hücre terminalleri kontur belirtti. (Df). Sağlam bir akson (d), kısmen kesilmiş akson (e), veya tamamen kaldırılmış bir akson (f) ile Mb bipolar hücre terminalleri Floresan görüntüler . Alexa 555 (A20501MP Invitrogen) floresan boya, kayıt öncesinde iç çözümü ile doluydu. Patch-klemp kayıt hemen sonra, retina dilim% 4 fosfat tampon çözeltisi (ağırlık / hacim) paraformaldehid (P6148, Sigma) (70013, Gibco) içine aktarılır ve 30 inkübemin. Dilimler anti-solmaya ajanlar (Biomeda corp) sulu montaj orta SuperFrost slaytlar (Fisher Scientific) üzerine monte edilmiştir. Alexa içeren 555 Mb bipolar hücre terminalleri konfokal lazer tarama mikroskobu (EKK 710, Carl Zeiss), 40x su daldırma amacı kullanarak 555 nm lazer hattı (kırmızı) ile incelendi. Akson terminalleri (mavi oklar) çıkıntılı küçük telodendria uzantılarının varlığını unutmayın. Ölçek çubuğu 10 mikron (f) göstermektedir. INL: iç nükleer tabaka, IPL: pleksiform iç tabakası, GCL: ganglion hücre tabakası.
Şekil 2 axotomized ve bozulmamış Mb bipolar hücre terminalleri elektriksel özellikleri. -70 MV -60 mV tutarak potansiyel bir gerilim kelepçe adım hiperpolarizasyon tarafından aktive (a, c) Geçici yanıt. -10 MV gerilim kelepçe adım kısa geçerli yanıtneden olabilir: 1) Tek bir hızlı üstel geçerli bir axotomized terminal göstergesi -70 mV (yüksek giriş direnci ile çürüme; paneli), ya da 2) -70 mV (göstergesidir düşük giriş direncine sahip bir çift üstel çürüme sağlam bir terminal paneli c) 12, 14, 15 ayrıca bkz. (B, d) Ca 2 + akımları ve membran kapasitans atlar -70 0 mV bir adım depolarizasyon tarafından uyarılmış. Zaman çözülmesi membran kapasitans ölçümleri dinlenme tutma potansiyeli -70 mV 6 üst üste 2 kHz sinüs uyaran kullanın. Kırmızı iz kapasitans veri noktalarının ortalama bir değerdir. Şekil 2b ve 2d kapasitans atlama yaklaşık 200 fF için eşit olduğunu unutmayın.
Şekil 3 Doğrudan ölçümler Ca 2 + görüntüleme sinyalleri, ekzositoz ve bir M inhibitör geri bildirimb bipolar hücre terminali. (A) Ca 2 geçici bir artış, bir Mb terminal telodendria + konsantrasyonu 200 ms (ok) -70 0 mV bir gerilim kelepçe adım depolarizasyon ile aktive edildi . Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 mcM), Ca 2 + göstergesi boya, yama pipet dahil edildi. Mb telodendria (kırmızı çizgi ile gösterilen ilgi bölge), (b) Sorumlu floresan görüntü. Nörotransmitter sürüm (ekzositoz) (c) Kısa vadeli sinaptik depresyon. 0 mV (200 ms inter-pulse aralığı üst iz) 20 ms depolarizations bir çifti tarafından uyarılmış Ca 2 + akımları (orta iz) ve membranın kapasitans (alt iz). Ok Ca 2 + güncel ve aynı zamanda komşu amacrine hücreler 15, 21 GABAerjik karşılıklı geribildirimle engelleme. Exocytosed proton etkisi gösterir. Ca 2 proton-aracılı inhibisyonu + güncel ve GAB dikkat edinAergic karşılıklı geribildirim inhibisyonu da sinaptik veziküllerin ekzositoz nedeniyle bir kapasitans atlama depolarizan ilk yanıt, sadece mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolünde kritik ve zor bir adım agar solüsyonu (protokol 3.4) retina parça transferi . Retina parça vitreus mizah ve artık dilim çözüm dikkatlice çıkarın ve bozulma veya bükmeden aktarmak için gereklidir. Bunu başarmak için, biz, bir ucu retina pozisyonu için açılı ucu forseps (11.251-35, Güzel Bilim Araçları) ile birlikte, 90 ° açı oluşturacak şekilde eğildi küçük bir spatula (21-401-25b, Fisherbrand) dilim çözüm transfer süreci boyunca parçası. Retina dilim ve spatula Artık dilim çözüm köşesi katlanmış veya haddelenmiş Kimwipes (Kimberly-Clark) yüzey dikkatli dabbing tarafından kaldırılabilir.
Enine retina dilimleri hazırlamak için başka bir yaygın yolu, filtre kağıt tabanlı protokol 23. Kısaca, tüm retinaya ters bir parçası Millipore filtre disk bir dikdörtgen parça (ganglion hücre yatıyordu bağlıfiltre kağıdı karşı er, fotoreseptör tabakada dilimleme makinesi yukarı bakacak şekilde) ve manuel dikey "başparmak" ile 250 mikron kalınlığında dilimler halinde kesilmiş (örneğin Narishige ST-20). Biz filtre kağıdı tabanlı protokol avantajları, sağlıklı fotoreseptörlerin ve sağlam Mb terminalleri axotomized bir artış oranı içeren bulabilirsiniz. Böylece retina dilim gömülü tek Mb terminallerinden ışık uyarılmış tepkiler bu filtre kağıdı yöntemi kullanın.
Filtre kağıt tabanlı protokolü üzerinden agar-tabanlı protokol avantajları 1) üretilen retina dilim bile, düz olduğunu ve herhangi bir iç nükleer tabaka veya retina pleksiform tabaka yama sağlar retina katmanları arasında net bir ayrım nispeten hasarsız hücre istenilen ve 2) immünhistokimya aşağıdaki elektrofizyolojik kayıt dilim sağlam ve düz bir geometri ve üzeri (1) bendinde belirtilen faktörler nedeniyle daha kolay yapılır. Hafif tepki kayıt için bir protokolvallahi 2 s agar tabanlı bir hazırlık retinal nöronların daha önce yayımlandı . Agar ve filtre kağıdı teknikleri bir arada kullanılan bir yatay retina dilim hazırlama, ayrıca daha önce Jüpiter 5 yayımlandı . Biz kendi ile birlikte farklı teknikler karşılaştırmak için bu videoları izlemenizi tavsiye.
Omurgalı retina dilim şerit tipi presinaptik terminallere doğrudan erişim sinaptik iletim şerit tipi aktif bölgeleri araştırmak için bize izin verir. Bu da bize doğrudan retina mikrodevreler sinaptik fizyoloji dersleri veriyor. Bu teknik, inhibitör amacrine hücreler ve ganglion hücrelerinin 1, 16, 10 spike postsinaptik ortakları, özellikle pre-ve post-sinaptik sinyalleri eşleştirilmiş kayıtları için faydalı olacaktır . Sıçan koklear iç saç hücreleri ve afferent dendritler arasında şerit tip sinaps Eşleştirilmiş kayıtları mümkündür ve 7 ile tarif edilmiştir. Kalsiyum hayal gücüyleng Mb bipolar hücre terminalleri akut ayrışmış hücreleri 8 ve retina dilimleri 17, goldfish amacrine hücreleri 3 olarak yapılmıştır. Son çalışmalar, in vivo ve in vitro transgenik zebrafish retina 4 optogenetic yaklaşımlar için büyük bir gelişme göstermiştir . Gelecek yönde olasılıkla bize davranışsal çalışmalar sonuçta lider,, in vitro dilim kayıtları ve in vivo görüntüleme arasında köprü sağlayacak elektrofizyolojik yöntemler, birlikte, bu transgenik teknikleri içerecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz hayır, ifşa etmek için yarışıyor.
Acknowledgments
Biz laboratuarımızda protokolü kullanarak başladığı agar gömülü retina dilim hazırlık yaptığı tür bir açıklama için teşekkür ederim Dr. Fred Rieke. Ayrıca resimde şematik bakış ve Dr Lori Vaskalis teşekkür ederim. Metin ve video hakkında faydalı yorumlar için Veeramuthu Balakrishnan ve Soyoun Cho. Bu çalışma bir NEI-NIH RO1 hibe ile desteklenen ve aynı zamanda kısmen Kore Hükümeti tarafından finanse edilen bir Kore Araştırma Vakfı Hibe Programı tarafından desteklenen [KRF-2008-357-E00032].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma-Aldrich | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments, Inc. | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige International | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna Medical Care | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisher Scientific | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus Corporation | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony Corporation | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu Corp. | C2400 | |
| Monitor | Sony Corporation | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalge Nunc international | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA Instruments | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO, by Life Technologies | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige International | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
References
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
- WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
- Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
- Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
- Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
- Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
- Ljungdahl, Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
- Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
- Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
- Deininger, S. -O. Imaging Mass Spectrometry. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).
- Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
- Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
- Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
- Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
- Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
