Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

Summary

Traditional, zweidimensionalen Zellkultur-Techniken oft in veränderten Eigenschaften in Bezug auf die Differenzierung Marker, Zytokine und Wachstumsfaktoren führen. Dreidimensionale Zellkulturen in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) wiederherstellt Expression vieler dieser Faktoren, wie hier mit einem extravillösen Trophoblasten-Zelllinie gezeigt.

Abstract

Das Feld der menschlichen Trophoblasten Forschung erleichtert das Verständnis der komplexen Umgebung während Plazentation gegründet. Aufgrund der Natur dieser Studien ist die menschliche In-vivo-Experimente unmöglich. Eine Kombination aus primären Kulturen, Explantation Kulturen und Trophoblasten Zelllinien ^{1-Unterstützung} unser Verständnis der Invasion der Gebärmutterwand ² und Umbau des Uterus Spiralarterien ^3,4 von extravillösen Trophoblastzellen (EVTs), die für die erfolgreiche Etablierung einer Schwangerschaft erforderlich ist. Trotz der Fülle an Wissen aus solchen Modellen entnommen, ist es akzeptiert, dass in vitro Zellkultur-Modellen mit EVT-like-Zelllinien Display zellulären Eigenschaften verändert, wenn ihre in vivo Pendants ^5,6 verglichen. Cells in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) kultiviert Display morphologische, phänotypische und funktionelle Eigenschaften von EVT-like-Zelllinien, die mehr genau imitieren Differenzierung in utero EVTs mit einer erhöhten Expression von Genen vermitteln Invasion (zB Matrix-Metalloproteinasen (MMPs)) und Trophoblast Differenzierung ^7,8,9. The Saint Georges Hospital Plazenta-Zelllinie-4 (SGHPL-4) (freundlicherweise von Dr. Guy Whitley und Dr. Judith Cartwright gespendet) ist ein EVT-like-Zelllinie, die für die Prüfung in der RCCS verwendet wurde.

Das Design des RCCS Kulturgefäß basiert auf dem Prinzip, dass Organe und Gewebe in einer dreidimensionalen (3-D-Umgebung) Funktion. Aufgrund der dynamischen Kulturbedingungen in dem Behälter, einschließlich der Bedingungen der physiologisch relevanten Scher-, Zellen in drei Dimensionen gewachsen bilden Aggregate auf Basis natürlicher zellulärer Affinitäten und differenzieren sich in organotypischen Gewebe-like Baugruppen ^10,11,12. Die Wartung einer Flüssigkeit Bahn bietet eine Low-Shear, turbulenzarme Umgebung ähnlich Bedingungen in vivo gefunden. Sedimentation der kultivierten Zellen durch Anpassung der Drehung entgegenGeschwindigkeit des RCCS, um eine konstante freien Fall der Zellen zu gewährleisten. Der Gasaustausch erfolgt durch eine durchlässige hydrophobe Membran auf der Rückseite des Bioreaktors befinden. Wie ihre Eltern Gewebe in vivo sind RCCS-gewachsenen Zellen in der Lage, chemische und molekulare Gradienten in drei Dimensionen (dh an ihrem apikalen, basalen und seitlichen Flächen) zu reagieren, weil sie auf der Oberfläche des porösen Mikroträger Perlen gezüchtet werden. Wenn als zweidimensionale Monolagen auf versiegelten Oberflächen wie Kunststoff gewachsen sind die Zellen dieser wichtigen Kommunikationsmittel, über die basale Fläche entzogen. Folglich ist die räumliche Beschränkungen durch die Umwelt stark beeinflussen, wie Zellen Sinn und decodieren Signale aus dem umgebenden Mikroumgebung, was darauf schließen lässt eine wichtige Rolle für die 3-D Milieu ^13.

Wir haben die RCCS verwendet werden, um biologisch sinnvolle 3-D Modelle der verschiedenen menschlichen epithelialen Geweben ^7,14,15,16 Ingenieur. Tatsächlich haben viele frühere Berichte DMonstrated, dass Zellen in der RCCS kultiviert werden können physiologisch relevanten Phänotypen, die nicht mit anderen Modellen ^10,17-21 möglich zu übernehmen. Zusammenfassend stellt Kultur in der RCCS eine einfache, reproduzierbare, High-Throughput-Plattform, die eine große Anzahl von differenzierten Zellen, die zugänglich für eine Vielzahl von experimentellen Manipulationen bietet. In dem folgenden Protokoll, mit EVTs als ein Beispiel, wir eine klare Beschreibung der erforderlichen Schritte, um dreidimensional Kultur adhärenter Zellen in der RCCS.

Protocol

1. Collagen Bead Vorbereitung Vor dem Laden EVTs für 3-D Zellkultur, muss man die Cytodex-3 Mikroträger Perlen vorzubereiten: Wiegen Sie die entsprechende Menge an Cytodex-3 Perlen für das Experiment erforderlich. Dieses Protokoll wird für die 10ml RCCS Schiffes angepasst, in dem 0,05 g Perlen benötigt werden. Für eine 50ml RCCS Schiff, entsprechend skalieren. In einem 50 mL autoklavierbar konischen Rohr, Mix 250 mg Cytodex-3 Perlen mit 12ml Dulbecco phosphatgepufferte Lösung (DPBS). Diese Men…

Discussion

Die Kultur hier vorgestellte Technik bietet den Ermittlern sehr invasiv EVT-ähnliche Zellen. Es wurde nun erkannt, dass ein Verlust der Differenzierung in Monoschichten durch die Hemmung der zellulären Reaktionen auf chemische und molekulare Signale in drei Dimensionen (apikalen, basalen und lateralen Zelloberflächen) ^10,13 auftritt. Diese Technik spiegelt Eigenschaften in utero auf eindringende EVT-Zellen festgestellt. Da das Verfahren ahmt konventionelle Monolayer Zellkultur Zeitkinetik, bietet …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Cytodex microcarrier beads	Sigma-Aldrich	C3275
Rotating Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-D	Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units
RCCS Disposable Units	Synthecon	Contact Synthecon
3ml Luer-Lock tip syringe	BD	309585
10ml wide-tip serological pipette	BD	357504
MEM Alpha	Invitrogen	12561-072
Leibovitz’s L-15 medium, powder	Invitrogen	41300-039
H2O, Endotoxin free	Fisher	MT-25-055-CM
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-7795
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-100
Fructose	Sigma-Aldrich	F3510-100
Galactose	Sigma-Aldrich	G5388-100
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528-250
HEPES	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine	Invitrogen	25030
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS)	Sigma-Aldrich	I1884
FBS	Invitrogen	10437
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140