ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞
Summary
伝統的な、二次元細胞培養技術は、しばしば、分化マーカー、サイトカインおよび増殖因子に関する変更特性になる。 extravillous栄養膜細胞株を以下に示すように回転する細胞培養系における三次元細胞培養（RCCS）は、これらの要因の多くの表現を再確立します。
Abstract
人間の栄養膜研究の分野では、胎盤形成の間に確立された複雑な環境を理解する上で役立ちます。これらの研究の性質上、in vivoの実験で 、人間は不可能です。初代培養、外植培養と栄養膜細胞株1の組み合わせは、子宮壁2の侵略と妊娠の成功確立のために必要とされるextravillous栄養膜細胞（EVTs）による子宮螺旋動脈3,4の改造の我々の理解をサポートしています。このようなモデルから収集した豊富な知識にもかかわらず、それは彼らのin vivoでの対応で 5,6と比較した場合、EVTのような細胞株を用いた in vitro細胞培養モデルにおいて細胞のプロパティを変更し表示することが受け入れられている。回転細胞培養システム（RCCS）で培養した細胞は、より密接にUで差別化を模倣することEVTのような細胞株の、形態学的表現型、および機能的特性を表示する侵略（例：マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP））と栄養膜の分化7,8,9を仲介する遺伝子の発現増加とテロササナEVTs、。サンジョルジュ病院胎盤細胞ライン- 4（SGHPL – 4）（親切に先生ガイウィットリーと博士ジュディスカートライトによる寄贈）RCCSでテストするために使用されたEVT様細胞株です。
RCCSの培養容器のデザインは、臓器および組織の3次元（3 – D）の環境で機能するという原則に基づいている。生理学的に適切なせん断の条件を含む容器内の動的な培養条件、のために、三次元的に培養した細胞は、天然の細胞の親和性に基づいて、凝集体を形成し、アセンブリ10,11,12器官のような組織に分化する。流体の軌道の維持は、 生体内に存在する条件と同様の低せん断、低乱流の環境を提供します。培養細胞の沈降は、回転を調整することによって打ち消された細胞の一定の自由落下を確実にするためにRCCSの速度。ガス交換は、バイオリアクターの背面に透過性の疎水性膜を介して行われます。それらが多孔質マイクロキャリアビーズの表面上で培養されているため、 生体内での彼らの親の組織と同様に、RCCSに成長した細胞は三次元（それらの、頂端基底、および側面即ち）で化学と分子勾配に対応することができます。プラスチックのような不浸透性の表面上の2次元単層として増殖させた場合、細胞はその基底面では、この重要なコミュニケーションを奪われている。そのため、環境によって課された空間の制約が深くこうして3次元環境13の重要な役割を示唆し、周囲の微小環境からどのように細胞の感覚とデコード信号に影響を与えます。
我々は、7,14,15,16、様々な人間の上皮組織の生物学的に意味のある3 – Dモデルを設計するRCCSを使用している。実際、多くの過去の報告では、DEMデータを持っているRCCSで培養された細胞は、他のモデル10,17-21では実現されていない生理学的に関連する表現型を担うことができることonstrated。要約すると、RCCSの文化は、実験操作の様々な従順な分化した細胞を大量に提供する簡単に、再現性、高スループットのプラットフォームを表します。次のプロトコルでは、例としてEVTsを使用して、我々ははっきりとRCCSに3次元的に培養接着細胞に必要な手順を説明します。
Protocol
Discussion
ここで紹介する培養技術は、高度に侵襲EVT様細胞との調査官が用意されています。それは今分化の損失が三次元（心尖部、基底、および横方向のセルの表面）10,13における化学と分子の手がかりに対する細胞応答の阻害に起因する単層で発生することが認識されている。この手法は、EVTの細胞を侵入に子宮内に記載されている特性を反映している。手順は、従来の単層組…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、健康補助金NIH / NICHD＃HD051998（CAMまで）の米国国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
Referências
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
- Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, S154-S154 (2011).
- Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
- Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
- Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
- LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
- Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
- Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
- Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat. Med. 4, 901-901 (1998).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
- Bentrup, H. ?. ?. n. e. r. z. u., K, . Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
- Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
- Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
- Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
- Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
- Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O’Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture – Principles and Methods. Handbooks. , (2005).
