Roterande Cell Culture System för mänskliga Cell Culture: Mänskliga trofoblasten Celler som modell
Summary
Traditionell, tvådimensionell cellodling tekniker leder ofta till förändrade egenskaper vad gäller differentiering markörer, cytokiner och tillväxtfaktorer. Tredimensionella cellodling i roterande cellodlingssystem (RCC) återupprättar uttrycket av många av dessa faktorer så som visas här med en extravillous trofoblasten cellinje.
Abstract
Området mänskliga trofoblasten forskning hjälpmedel för att förstå den komplexa miljö som fastställdes under placentation. På grund av karaktären av dessa studier, är det mänskliga in vivo experiment omöjligt. En kombination av primära kulturer, kulturer Explantation och trofoblasten cellinjer 1 bidra till vår förståelse invasion av livmoderväggen 2 och ombyggnad av livmodern spiral artärer 3,4 av extravillous trofoblasten celler (EVTs), som krävs för en lyckad etablering av graviditeten. Trots den mängd kunskap som samlats in från sådana modeller, är det accepterat att in vitro-modeller cellodling med hjälp av EVT-liknande cellinjer display ändras cellulära egenskaper jämfört med de in vivo motsvarigheter 5,6. Celler odlade i roterande cellodlingssystem (RCC) display morfologiska, fenotypiska och funktionella egenskaper EVT-liknande cellinjer som närmare efterliknar differentiera i UTero EVTs, med ökat uttryck av gener förmedla invasion (t.ex. metalloproteinaser (MMPs)) och trofoblasten differentiering 7,8,9. Saint Georges Hospital placenta cellinje-4 (SGHPL-4) (vänligt donerad av Dr Guy Whitley och Dr Judith Cartwright) är en EVT-liknande cellinje som användes för att testa i RCC.
Utformningen av RCC kulturen fartyget bygger på principen att organ och vävnader fungerar i en tredimensionell (3-D) miljö. På grund av den dynamiska kulturen förutsättningar i fartyget, inklusive villkor för fysiologiskt relevant sax, celler som odlas i tre dimensioner bildar aggregat bygger på naturliga cellulära tillhörighet och differentierar till organotypic vävnad-liknande församlingar 10,11,12. Upprätthållandet av en vätska bana ger en låg skjuvning, låg turbulens miljö som liknar förhållandena i vivo. Sedimentation av de odlade cellerna motverkas genom att justera rotationenhastigheten för RCC att säkerställa en konstant fritt fall av celler. Gasutbyte sker genom en genomsläpplig hydrofobt membran på baksidan av bioreaktor. Liksom deras föräldrar vävnad in vivo, RCC-odlade celler kan svara på kemiska och molekylära gradienter i tre dimensioner (dvs på deras apikala, basala och laterala ytor) eftersom de är odlade på ytan av porösa microcarrier pärlor. När odlas som tvådimensionella monolager på ogenomträngliga ytor som plast, celler berövas denna viktiga kommunikation på sina basala yta. Följaktligen rumsliga begränsningar som miljön påverkar djupt hur celler förnuft och signaler avkoda från den omgivande mikromiljö, vilket innebär en viktig roll för 3-D miljö 13.
Vi har använt RCC att konstruera biologiskt meningsfulla 3-D-modeller av olika mänskliga epitelvävnader 7,14,15,16. Faktum är att många tidigare rapporter har markonstrated att celler odlade i RCC kan anta fysiologiskt relevanta fenotyper som inte har varit möjligt med andra modeller 10,17-21. Sammanfattningsvis representerar kultur i RCC ett enkelt, reproducerbar, high-throughput plattform som ger ett stort antal differentierade celler som kan bli föremål för en mängd olika experimentella manipulationer. I följande protokoll, med EVTs som exempel beskriver vi tydligt de steg som krävs för att tredimensionellt kultur anhängare celler i RCC.
Protocol
Discussion
Kulturen Tekniken som presenteras här ger utredarna med mycket invasiva EVT-liknande celler. Det har nu erkänt att en förlust av differentiering förekommer i monolager grund av hämning av cellulära svaren på kemiska och molekylära signaler i tre dimensioner (apikala, basala och laterala cellytan) 10,13. Denna teknik speglar egenskaper som noterats i livmodern på invaderande EVT celler. Eftersom förfarandet härmar konventionella cellslager vävnad kinetik kultur tiden, men ger celler med di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av amerikanska National Institutes of Health bidrag NIH / NICHD # HD051998 (till CAM).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
Referências
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
- Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, S154-S154 (2011).
- Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
- Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
- Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
- LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
- Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
- Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
- Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat. Med. 4, 901-901 (1998).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
- Bentrup, H. ?. ?. n. e. r. z. u., K, . Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
- Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
- Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
- Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
- Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
- Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O’Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture – Principles and Methods. Handbooks. , (2005).
