Summary
우리는 infiltrative 설치 매체로 perfluorodecalin의 사용을 설명합니다. 이것이 영상의 깊이를 개선하기위한 간단한 방법입니다
Abstract
생물 학적 샘플로 깊이 고해상도 이미지를 획득의 문제는 크게 1 인정받고 있습니다. 이러한 추가적인 문제가 세포와 airspaces 사이의 생물 학적 조직과 광학 시스템의 나머지 부분 사이의 세포 구성 요소 사이의 굴절률에 여러 전환에서 발생하는 식물 잎이나 척추 폐의 해면 mesophyll으로 공기 주입 조직에. 또한, 굴절률의 불일치는 형광단 여기 및 형광 현미경에서 신호 방출의 감쇄로 이어집니다. 우리는 광학 레이저의 파워에 손상을 증가 resorting 않고, 깊이에서 공촛점 현미경 (LSCM) 샘플 이미지를 스캐닝 레이저를 개선하고 최소의 생리적 영향이있다 infiltrative 영상 매체로 여기 perfluorocarbon의 응용 프로그램 perfluorodecalin (PFD)를 설명합니다. 우리는 그것의 결과로 광학 Arabidopsis thaliana 복잡 잎 조직과 함께 PFD의 사용을 위해 프로토콜을 설명구조 (그림 1). PFD이 사용 세에 적합하게 속성을 가지고 있습니다. PFD의 굴절률 (1.313)은 물 (1.333)의와 비교하고 공기 (1.000)보다 cytosol (약 1.4)의에 가까운 것입니다. 또한, PFD가 아닌 형광등, 즉시 가능하며 무독성이다. 그것이 홍수하실 수 있습니다 stomatal 침투 4,에 대한 - PFD의 낮은 표면 장력 (19 dynes cm -1)는 물 (72 dynes cm -1)의보다 낮은 것이며, 또한 한도 (30 다인의 cm -1 25) 다음과 같습니다 잠재적으로 파괴적인 진공이나 계면 활성제의 응용 프로그램없이 해면 mesophyll의 airspaces. 마지막으로 결정적인 PFD는 CO 2와 가스 교환이 때문에 시료에 생리적인 영향을 최소화, 홍수 조직에 유지 수 있습니다 O 2, 분해에 대한 큰 용량을했습니다. 이 속성은 부분 액체 호흡과 폐 infla를 포함 다양한 어플 리케이션에 사용되고있다기 5,6, 수술 7, 인공 혈액 8, 성장의 산소 미디어 9, 식물 10 얼음 결정 형성 연구. 현재는 라이브 공촛점 이미징을위한 물 또는 수성 버퍼에 조직을 마운트하는 것이 일반적이다. 우리는 마운트 매체로 PFD의 사용은 기존의 관행에 대한 개선을 나타내는 및 이미징에 대한 라이브 잎 전체 샘플의 간단한 준비를 허용 생각합니다.
Protocol
아래 Arabidopsis thaliana 프로토콜은 단풍의 infiltrative 장착 매체로 PFD 사용하기위한 간단한 방법을 설명하지만이 방법은 공기 이미징이 풍부한 조직이 원하는됩니다 다양한 어플 리케이션에 사용할 수 것으로 예상.
1. PFD의 마운트 잎 샘플
- polydimethylsiloxane의 가스 투과 가스켓 (PDMS, 캐롤라이나 전망대 젤)과 현미경 슬라이드를 준비합니다. PDMS는 점탄성 폴리머이며 실험적인 요구 사항에 맞는 챔버를 제공하기 위해 성형 수 있습니다.
- 공기와 PFD 평형. 이것은 공기와 버블링 또는 공기 주입 병에 PFD의 작은 볼륨을 흔들어에 의해 달성있을 수 있습니다.
- 가만히 따르다가 오픈 페트리 접시에 PFD 및 전체 묘목 또는 5 분 PFD에 excised 잎을 떠. 조직 (그림 2 (A)), 반투명 vitrified 조직의 연상이 될 것입니다. 나뭇잎이 PFD, depen에 노출보다 어두운 또는 밝은 나타날 수 있습니다조명 조건과 조직의 나이에 땡 사용됩니다.
- 공기 equilibrated PFD와 PDMS 챔버를 입력하고 조심스럽게 PDMS 챔버에 부화 페트리 접시에서 조직 샘플을 전송할 수 있습니다. 실험 요구 사항에 따라 coverslip와 이미지로 슬라이드를 밀봉합니다.
- 참고 : PFD 또한 coverslip에 만들어진 오픈 챔버 또는 재관류 챔버에서 잘 수행하고 실리콘 그리스와 호환됩니다. 그것이 그들을 녹이고으로 PFD는 테플론 구성 요소와 호환되지 않습니다.
2. 대표 결과 :
PFD - incubated 잎 샘플을 현미경으로 검사 airspaces의 대부분은. 그림 2 (B)는 PFD에서 일시 중지 재조합 GFP와 홍수 airspaces을 보여줍니다 침수 것을 보여줍니다. 그것은 나뭇잎이 PFD와 부화시 홍수는 것을 분명하지만, 공기의 가끔 주머니가 남아있을 수 있습니다. 물은 이러한 조건 하에서 잎을 홍수하지 않습니다. 샘플 LSCM는 incubated과에 마운트 IR, 물 또는 PFD 가능한 영상의 깊이에 물과 공기를 통해 장점 (그림 3) 준 PFD 보여줍니다. 그림 3에 주어진 예제는 공기, 물, PFD 탑재 Arabidopsis가 cytosolically화된 비너스, 35S 프로 모터하에 constitutively 표현 YFP 11 변종을 표현하는 단풍 보여줍니다. PFD과 물을 비교했을 때 우리는 영상의 깊이 약 2 배 증가를 볼 수 있습니다. 이것은 PFD를 사용하는 경우 본 정확한 개선이 렌즈 및 사용 조직의 유형의 수치 조리개에 따라 다릅니다 것을 그러나, 주목하여야한다. 우리는 PFD 치료 모종의 세포질 스트리밍 및 루트 헤어 연신율, 건강한 식물의 각 지표를 볼 수있다. 또한 우리는 FV / FM, 식물 12 광합성 기능의 측정은 이미지에 사용된 timescales 이상 참을 한도 내에서 유지 2 나타났습니다.
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그림 1. 식물 잎의 복잡 및 광학 의미
A.의 해부 학적 특징을 보여주는 Diagrammatical 표현 설정 광학 관련 thaliana의 잎. 사용되는 약어는 OBJ 있습니다. = 객관적 렌즈, imm. = 침지 오일, cov. = coverslip, mnt. = mountant, 컷. = 표피, 광고. EP. = adaxial 표피, 성. = stomatal 기공, SP. = 해면 mesophyll로 = 공기 공간, 친구. = 방어벽의 mesophyll, VB = 혈관 다발, 광고. EP. = adaxial 표피. 세포 벽은 검은 선으로 표시됩니다.
그림 2. PFD는 쉽게 Arabidopsis 치르곤
(A) 공기, 물에서 incubated 5 분 PFD와 Leica MZ16F 현미경 (Leica 마이크로 시스템즈 (영국) (주), 밀튼 케인즈 -, 영국)와 Leica DCF3000FX 디지털 카메라를 사용하여 몇 군데 잎. 주피터 로고는 아세테이트 필름에 인쇄된 이리저리 조명했다가벼운 상자 아래 해요. 노출 시간은 89 MS했고 모든 이미지는 수집 동일하게 처리되었습니다. 스케일 바는 2mm를 나타냅니다.
(B) PFD는 재조합 녹색 형광 단백질 (GFP)을 정화하는 생체내에 airspaces을 delimits 들고. GFP는 거짓 색 녹색이며, 빨간색은 엽록소 mesophyll 세포를 delimits 자동 형광을 표시하는 데 사용됩니다. (그림 2 (B) 허가 및 Littlejohn 외에서 사용 가능한 모든 기술적 세부 재현. 2010 2). 스케일 바는 25 미터를 나타냅니다
그림 3. PFD는 나뭇잎에 공촛점 이미징을 향상
A. 그대로의 thaliana의 cytoplasmically화된 비너스 형광 (녹색)과 엽록소의 autofluorescence (적색)을 보여주는 LSCM 이미지는 공기, 물 또는 PFD에서 몇 군데 떠납니다. 여기 파장은 514 nm의 형광 방출했고이 비너스의 604 nm의 518 nm의에서 녹음되었으며에서 657 nm의chloroplasts에 대한 679 NM. 각 패널은 5 μm의 간격으로 취득한 11 공촛점 이미지의 Z - 스택에서 가져온 단일 공촛점 섹션입니다. 이들은 보조 영화를 생산하는 데 사용되었습니다 1 μm의 간격에서 획득한 59 이미지의 전체 Z - 스택에서 추출한되었습니다. 깊이 측정은 표피 표면에 상대적으로 부여됩니다. 동일 처리되었습니다 대표 이미지는, 표시됩니다. 이러한 현미경 설정으로 실험 내용은 Littlejohn 외., 2010 2 찾은 것과 동일합니다. Scalebars 20 μm의를 나타냅니다.
Discussion
이것은 공기 주입 또는 광학 복잡한 조직의 현미경을 향상시킬 수있는 간단하고 사용하기 쉬운 기술입니다. 우리는 기술이 몇 가지 강력한 장점을 가지고 있으며, 우리는 그것이 공기 풍부한 조직에 관한 생물 학적 질문을 명료하게하다하는 데 사용될 수 있기를 바랍니다 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 그것은 식물 mesophyll이나 폐에 병원체 공격의 연구에 대한 자연 선택이 될 것입니다. 우리는 또한 기술의 한계를 알고 있습니다. 우리는 더 굴절률 정합 작업 있으며, 긴 timescale 실험시 현미경의 다른 모드 및 perfluorocarbon mountant 보충과 함께 사용합니다. 우리는 또한 PFCs의 주요 장점 중 하나는, 즉 생물학적으로 불활성 flipside가되고, 그렇게, 인식하고 있습니다. PFCs는 쉽게 또한 쉽게 이러한 호르몬, 약물, 그리고 다른 작은 분자 또는 이온과 같은 관심의 화합물을 전달하는 데 사용할 수 없다는 것을 의미 생물 학적 분자를 분해하지 않습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 그의 조언과 Exeter에의 Bioimaging 시설의 대학은 Exeter의 대학의 교수 니콜라스 노프 감사하고 싶습니다. 기금은 영국의 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (부여 BB/E002682/1 참조)에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
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