Summary
Vi beskriver bruk av perfluorodecalin som et infiltrerende montering medium. Dette er en enkel metode for å forbedre dybde bildebehandling i
Abstract
Problemet med å skaffe høyoppløselige bilder dypt inn biologiske prøver er allment anerkjent 1. I luftfylte vev som svampete mesophyll av plante løv eller virveldyr lungene ytterligere vansker oppstå fra flere overganger i brytningsindeks mellom cellulære komponenter, mellom celler og luftrom og mellom biologisk vev og resten av det optiske systemet. Videre brytningsindeks uoverensstemmelser føre til demping av fluoroforen eksitasjon og signal utslipp i fluorescens mikroskopi. Vi beskriver her anvendelsen av perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), som et infiltrerende tenkelig medium som optisk forbedrer laser scanning konfokalmikroskopi (LSCM) prøve bildebehandling i dypet, uten å ty til skade øker i laser kraft og har minimal fysiologisk innvirkning to. Vi beskriver protokollen for bruk av PFD med Arabidopsis thaliana blad vev, som er optisk kompleks som et resultat av sinstruktur (figur 1). PFD har en rekke egenskaper som gjør den egnet til denne bruken 3. Den brytningsindeks PFD (1.313) er sammenlignbar med vann (1.333) og er nærmere at av cytosol (ca. 1,4) enn luft (1.000). I tillegg er PFD lett tilgjengelig, ikke-fluorescerende og er ikke giftig. Den lave overflatespenningen i PFD (19 dynes cm -1) er lavere enn vann (72 dynes cm -1) og også under grenseverdien (25-30 Dyne cm -1) for stomatal penetration 4, som gjør at det flom spongy mesophyll luftrom uten bruk av en potensielt ødeleggende vakuum eller surfactant. Endelig og avgjørende, har PFD stor kapasitet for oppløsning CO 2 og 2 O, som lar gassutveksling å bli opprettholdt i den oversvømte vev, og dermed minimere fysiologiske innvirkning på prøven. Disse egenskapene har blitt brukt i ulike applikasjoner som inkluderer delvis flytende puste og lunge inflasjon 5,6, kirurgi 7, kunstig blod 8, oksygenering av vekstmedier 9, og studier av iskrystall dannes i planter 10. Foreløpig er det vanlig å montere vev i vann eller med vannholdige buffer for live confocal imaging. Vi anser at bruk av PFD som montering medium representerer en forbedring på eksisterende praksis og gir en enkel tilberedelse av levende hele blad prøver for imaging.
Protocol
Protokollen nedenfor beskriver en enkel metode for å bruke PFD som et infiltrerende montering medium i Arabidopsis thaliana blader, men vi forventer at denne metoden kan brukes i en rekke applikasjoner der bildebehandling air-rike vev er ønskelig.
1. Montering blad prøver i PFD
- Forbered et objektglass med en gass-gjennomtrengelig pakning av polydimetylsiloksan (PDMS, Carolina Observation Gel). PDMS er en viscoelastic polymer og kan formes for å gi et kammer skreddersydd til eksperimentelle krav.
- Likevekt oljefordelingsfunksjonen med luft. Dette kan oppnås ved å boble med luft eller ved å riste et lite volum av PFD i en luft-fylt flasken.
- Dekanter PFD inn i en åpen petriskål og flyte en hel frøplante eller excised blad på PFD i 5 minutter. Vevet skulle bli gjennomskinnelig, minner om vitrified vev (Figur 2 (a)). Bladene kan være mørkere eller lysere enn før eksponering til PFD, avhengighet tilding på lysforhold og en alder av vev som brukes.
- Fyll PDMS kammer med luft-likevekt PFD og nøye overføre vevsprøver fra inkubasjonstiden petriskål til PDMS kammeret. Forsegle lysbilde med et dekkglass og bilde i henhold til eksperimentelle krav.
- Merk: PFD også fungerer godt i et åpent kammer bygget på en dekkglass eller i en perfusjon kammer og er kompatibel med silisium fett. PFD er ikke kompatibel med Teflon komponenter som den oppløser dem.
2. Representant Resultater:
Mikroskopiske inspeksjon av PFD-inkubert blad prøvene viser at flertallet av luftrom er oversvømmet. Figur 2 (b) viser luftrom oversvømmet med rekombinant GFP suspendert i PFD. Det er tydelig at bladet er oversvømmet ved inkubasjon med PFD, men sporadiske lommer av luft kan forbli. Vann flom ikke bladet under disse forholdene. LSCM av prøvene inkubert og montert i en ir, vann eller PFD viser at PFD gir en fordel i forhold til vann og luft i dybden av imaging mulig (figur 3). Eksempelet gitt i Figur 3 viser luft, vann og PFD montert Arabidopsis forlater uttrykke cytosolically lokalisert Venus, en variant av YFP 11 som uttrykkes konstitutivt under 35S promotor. Vi kan se en tilnærmet 2-fold økning i dybden av bildebehandling når man sammenligner oljefordelingsfunksjonen og vann. Det bemerkes imidlertid at det presise forbedringen sett ved bruk av PFD varierer med numerisk apertur på objektivet og type vev som brukes. Vi har sett cytoplasmatiske streaming og rot hår forlengelse i PFD behandlet frøplanter, hver indikasjon av sunne planter. I tillegg har vi vist to at Fv / Fm, en måling av fotosyntetiske funksjon av planter 12 forblir innenfor akseptable grenser enn tidsrammer brukt i bildebehandling.
3394fig1.jpg "/>
Figur 1. Plant blad kompleksitet og optiske implikasjoner
Diagrammatical representasjon viser anatomiske trekk ved A. thaliana blad i forhold til den optiske set-up. Forkortelser som brukes er obj. = Objektiv, IMM. = Nedsenking væske, COV. = Dekkglass, mnt. = Mountant, kuttet. = Cuticle, ad. ep. = Adaxial epidermis, st. = Stomatal pore, sp. = Svampaktig mesophyll, som = luftrom, pal. = Palisade mesophyll, vb = vaskulær bunt, ad. ep. = Adaxial epidermis. Celleveggene er indikert med svarte linjer.
Figur 2. PFD penetrerer lett Arabidopsis løv
(A) forlater inkubert i luft, vann eller PFD i 5 minutter og avbildes ved hjelp av en Leica DCF3000FX digitalkamera med Leica MZ16F mikroskop (Leica Microsystems (Storbritannia) Ltd, Milton-Keynes, Storbritannia). Den Jove logo ble trykket på acetat film og opplyst from nedenfor med en lys boks. Eksponeringstid var 89 ms og alle bilder ble samlet inn og behandlet likt. Scale søylene representerer 2 mm.
(B) PFD bærer renset rekombinant grønt fluorescerende protein (GFP) delimits luftrom in vivo. GFP er falsk farget grønt og rødt brukes til å vise klorofyll auto-fluorescens, som delimits den mesophyll cellene. (Figur 2 (b) gjengitt med tillatelse og full tekniske detaljer er tilgjengelige i Littlejohn et al. 2 010 2). Scale søylene representerer 25 m.
Figur 3. PFD forbedrer confocal bildebehandling i blader
LSCM bilder som viser cytoplasmically lokaliserte Venus fluorescens (grønn) og klorofyll autofluorescence (rød) i intakt A. thaliana bladene fotografert i luft, vann eller PFD. Eksitasjon bølgelengde var 514 nm og fluorescens utslipp ble spilt inn 518 nm 604 nm for Venus og på 657 nm679 nm for kloroplaster. Hvert panel er et enkelt confocal seksjon hentet fra en Z-stack på 11 confocal bilder kjøpt til 5 mikrometer intervaller. Disse ble trukket ut fra en full Z-stack av 59 bilder kjøpt på 1 mikrometer intervaller, som har blitt brukt til å produsere supplerende filmer. Dybdemålinger er gitt i forhold til epidermal overflaten. Representative bildene, som ble behandlet likt, er vist. Eksperimentelle detaljer som mikroskop innstillingene er identiske med de som finnes i Littlejohn et al., 2010 2.. Scalebars representerer 20 mikrometer.
Discussion
Dette er en enkel og lett å bruke teknikken til å forbedre mikroskopi av luftfylte eller optisk komplekse vev. Vi har vist at teknikken har noen sterke fordeler og vi håper at det vil bli brukt til å belyse biologisk spørsmål knyttet til luft-rike vev. For eksempel ville det være et naturlig valg for studier av patogen angrep i anlegget mesophyll eller i lungene. Vi er også klar over begrensningene av teknikken. Vi jobber med bedre brytningsindeks matching, bruk med andre former for mikroskopi, og perfluorocarbon mountant påfyll under lange tidsskala eksperimenter. Vi erkjenner også, men at en av de viktigste fordelene av PFK, nemlig å være biologisk inert har en flipside. PFK ikke lett oppløse biologiske molekyler som også innebærer at de ikke lett kan brukes til å levere forbindelser av interesse, slik som hormoner, narkotika og andre små molekyler eller ioner.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke professor Nicholas Smirnoff av University of Exeter for hans råd og University of Exeter Bioimaging Facility. Finansieringen ble gitt av den britiske Bioteknologi og Biological Sciences Research Council (tilskudd referanse BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J.
- Schönherr, J., Bukovac, M. J.
- Davies, M. W.
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
