Intrakraniel Implantation med efterfølgende 3D In Vivo Bioluminescent Scanning af murine gliomer

Summary

Intrakraniel implantation af GL261 celler i C57BL / 6 mus producerer maligne gliomer, at rekapitulere mange af kendetegnene ved menneskelige glioblastoma multiforme. Vi brugte GL261 celler stabilt udtrykker luciferase til at tillade os at bruge

Abstract

Musen gliom 261 (GL261) er anerkendt som en in vivo model system, der sammenfatter mange af funktionerne i menneskelige glioblastom multiforme (GBM). Cellen linje blev oprindeligt fremkaldt af intrakranial injektion af 3-methyl-cholantrene ind i en C57BL / 6 syngeneic musestamme ^1; derfor, immunologisk kompetente C57BL / 6 mus kan bruges. Mens vi bruger GL261, kan følgende protokol blive anvendt til implantation og kontrol af enhver intrakraniel mus tumor model. GL261 celler blev manipuleret til at stabilt udtrykke ildflue luciferase (GL261-Luc). Vi skabte også den lysere GL261-luc2 cellelinie ved stabil transfektion af luc2 genet udtrykkes fra CMV promotor. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mus (albino variant af C57BL / 6) fra National Cancer Institute, Frederick, MD blev brugt til at eliminere lys dæmpningen forårsaget af sort hud og pels. Med brugen af albino C57BL / 6 mus, in vivo imaging ved hjælp af IVIS Spectrum in vivo imaldring er muligt fra den dag, implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Den GL261-Luc og GL261-luc2 cellelinier viste den samme in vivo adfærd som forældrenes GL261 celler. Nogle af de fælles histologiske træk til stede i humane GBMS og denne mus model omfatter: tumor nekrose, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, og inflammation ^1.

Forud for implantation dyr var bedøvet med en intraperitoneal injektion af ketamin (50 mg / kg), xylazin (5 mg / kg) og buprenorphin (0,05 mg / kg), placeret i et stereotaktisk apparat og et snit blev lavet med en skalpel over kraniel midterlinjen. En burrhole blev lavet 0,1 mm posteriort for bregma og 2,3 mm til højre for midterlinjen. En kanylen var stukket ind i en dybde på 3 mm og trukket tilbage 0.4mm til en dybde på 2,6 mm. To μl af GL261-Luc eller GL261-luc2 celler (10 ⁷ celler / ml) blev infunderes i løbet af 3 minutter. Den burrhole blev lukketmed bonewax og snittet var sutureres.

Efter stereotaktisk implantation af selvlysende celler kan påvises fra den dag, implantation og tumor kan analyseres ved hjælp af 3D-billede rekonstruktion træk ved IVIS Spectrum instrument. Dyr får en subkutan injektion af 150μg luciferin / kg legemsvægt 20 min før billeddannelse. Tumor byrde er kvantificeres ved hjælp betyde tumor bioluminescens over tid. Tumor-bærende mus blev der observeret dagligt for at vurdere, sygelighed og blev aflivet, når en eller flere af følgende symptomer er til stede: sløvhed, manglende ambulate, krum stilling, manglende groom, anoreksi resulterer i> 10% vægttab. Tumorer var tydeligt i alle de dyr på obduktion.

Protocol

1. Cell Culture

1. Den GL26 cellelinie er indhentet fra afdelingen for kræft behandling og diagnostik (DCTD) National Cancer Institute (NCI), Frederick, MD. For at lette en kvantitativ måling af tumor vækst GL261 celler blev foretaget bioluminiscerende bruger Lentiphos HT System (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) med Lenti-X HT emballagemix (Clontech Laboratories, Inc.) og FUW- GL plasmid (en generøs gave fra laboratoriet over JB Rubin, MD, ph.d.). Cellerne blev opretholdt i Dulbecco ændrede Eagle er Medium (DMEM) med 10% tetracyklin-fri Føtalt kalveserum (FCS; Clontech Laboratories, Inc.). GL261 celler blev også stabilt tilført de gen, der koder luc2 bruger pGL4.51 [luc2 / CMV / Neo] vektor (Promega Corp, Madison, WI) og FuGENE 6 transfektion Reagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) efter betingelser fastsat af producenten. Den luc2 gen er et codon optimeret version af Firefly luciferaSE, der giver en betydeligt højere lysudbytte end standard Luc genet. Stabil transfectants blev udvalgt og vedligeholdes i DMEM medier, der indeholder 10% FCS og 100 mg / ml Geneticin (G418, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA).
2. Forud for implantation de dyrkede celler høstes af trypsinzation, vasket en gang i DMEM uden serum og resuspenderet i DMEM uden serum i en koncentration på 1 x 10 ⁷ celler / ml.

2. Kirurgi Konfiguration ²

1. Et sterilt miljø opretholdes i hele operationen, herunder alle kirurgiske instrumenter, forsyninger, handsker, gardiner, mv.
2. Ti uger gamle C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (albino C57BL / 6) mus er købt fra National Cancer Institute ved Frederick Animal Production Program og bruges i en gennemsnitlig vægt på 20 gram (NCI, Frederick, MD).
3. Dyrene er bedøvet ved intraperitoneal injektion af xylazin (5 mg / kg), ketamin (50 mg / kg) og buprenorphin (0,05 mg / kg). Tile knivspids er gjort for at sikre, at dyret er tilstrækkeligt bedøvet før operationen er begyndt. Movement (selv om lidt) af nogen del af dyret er en indikation af en reduktion i niveauet af anæstesi. Animal er straks får en ekstra 3,3 mg / kg xylazin og 26,6 mg / kg ketamin. Kropstemperatur er opretholdt ved hjælp af en lampe og sterile forbindinger, der dækker kroppen.
4. Når dyret er korrekt bedøvet, placeres de på polstret sengen af ​​stereotaktisk headframe (Model 900 Mindre Husdyrs Stereotaxic, David Kopf Instrumenter) [Figur 1].
5. En lille mængde (1 / 4 tomme) i AKWA Tears Oftalmologiske Smøremiddel salve anvendes over hornhinder.
6. Dyret er sikret i stereotaktisk ramme ved at åbne dyrets mund (ved at placere din pegefinger og tommelfinger rundt om dyrets kæbe) og skubbe den øverste fortænder ind i fordybning i stereotaktisk ramme. Klemmen er strammet for at sikre dyrets hoved ind i headsettet at sikre, at the hoved er justeret og øjnene er centreret, og sørg dog ikke at udøve unødig kraft på dyrets hoved.
7. The O ₂ slangen er tapede nede ved dyrets næsebor. Ilt flow 0,5 l / min.
8. Den nederste del af ryggen og halen er tapede ned til stereotaktisk sengen og være omhyggelig med ikke at gå på kompromis respirations.
9. Den kirurgiske incisionssted er barberet. Povidine-Jod Swab Sticks bruges til at vaske området mellem øjnene at gå tilbage til området mellem ørerne med jod, og sørg for jod ikke drypper ind i dyrets øjne.
10. Cellerne er forberedt til implantation lige før operationen og er med jævne blandes for at sikre, at de ikke afregne.
11. A 10 μl, er 50 mm Verdens Precision Instrument (WPI), Sarasota, FL, sprøjte med 26 gauge facetslebne kanyle fyldt med cellen inokulum. Hvis cellerne synes at være klumpet sammen kan det være nødvendigt at genindlæse sprøjten.
12. De 10 μl sprøjte er derefter placeret i UMP3-1 UltramicroPump mikro injektor (WPI, Sarasota, FL).

3. Intrakraniel Implantation ²

1. Huden incision er lavet ved hjælp af en størrelse 15 skalpelblad og tandede pincet. En 10-15 mm incision er lavet på langs fra mellem dyrets øjne, bevæger sig i retning af dyrets ører udsætte bregma (krydset af sagittal og koronale suturer på toppen af ​​kraniet). Vær sikker på at korrekt identificere bregma for den let kan forveksles med sinus område, som er distalt for bregma [Figur 2].
2. Når dyret er bedøvet den modtager en intra-incisional injektion af 0,25% (2,5 mg / ml) bupivacain.
3. En burrhole er lavet 0,1 mm posteriort for bregma og 2,3 mm til højre for midterlinjen ved langsomt at dreje en 16 gauge 1 ½ tomme kanyle i hånden, at anvende lidt pres til nålen, mens dreje, indtil kraniet er trængt ind og hjernen er udsat for.
4. Sprøjtenålen er flyttet ned i position ved hjælp af Microdrive STEreotactic sprøjteholderen, indtil det netop rører hjernens overflade. Fra denne position, er nålen rykkede ind i hjernen til en dybde på 3 mm og holdes på plads i 3 minutter.
5. Nålen trækkes 0,4 mm til en samlet dybde på 2,6 mm under overfladen af ​​hjernen, hvilket skaber en lille lomme, hvor cellerne skal infunderes. Det er valgfrit på dette tidspunkt at tage et røntgenbillede af nålen i dyret for at sikre korrekt placering og dybde.
6. Cellesuspensionen er infunderet over 3 minutter ved hjælp af mikro-injektor indstillet til en volumen på 2000 NL (2 μL) med en infusionshastighed på 667 nL / minut.
7. Nålen er efterladt på stedet i 2 minutter for at forhindre udsivning fra infusionsstedet.
8. Nålen er langsomt trukket sig helt.
9. Den burrhole er fyldt med knogler voks med en Penfield dissektoren.
10. Snittet er syet med en 4-0 (1.5 Metric) vicryl sutur og sørg for der ikke er store huller er tilbage i huden. Vicryl er et suturmateriale, der opløsers, og derfor suturer behøver ikke at blive fjernet, når snittet er helet.
11. Efter operationen dyrene er anbragt i bur under en varmelampe, der er indstillet til den ønskede højde til at opvarme bunden overfladen af ​​buret til 30 ° C. Når dyrene er helt vågen (som bedømmes ud fra normale udvikling i buret) de er vendt tilbage til gruppen boliger. Oral ibuprofen er tilføjet til deres drikkevand i 5 dage postoperativt. 100 mg af børns ibuprofen (100mg/5mL) er føjet til en standard 473 ml gnaver vandflaske. Dyrene observeres dagligt og filmede og vejet hver 3 dage. To uger efter implantation observation øges til to gange om dagen. Dyrene aflives, når de viser tegn på faldende sundhed, som omfatter krum stilling, bevægelseshæmmede og synlige vægttab (≥ 20%). Disse symptomer er en offentliggjort reaktion på tumoren, og de reproducerbart synes ca 1 dag før død som følge af tumor.

4. In vivo 3

1. Start [Living Image] software.
2. Den IVIS Imaging System er initialiseret ved at klikke på [Initialize IVIS System] knappen i nederste højre side af kontrolpanelet.
3. Vælg [Selvlysende] billedbehandlingstype i øverste venstre side af kontrolpanelet.
4. For at bestemme det optimale tidspunkt af billeddata efter luciferin injektion en kinetisk undersøgelse er nødvendig [Figur 3]. Denne beskrivelse er til ildflue luciferase;
   1. Injicér 10μl / g kropsvægt af D-luciferin Firefly (15mg/ml i PBS; Caliper Life Sciences Butik XR-1001 eller et lignende produkt fra en anden leverandør) ind i dyret, som beskrevet nedenfor.
   2. Vent 3 minutter, og så bedøver musen ved at sætte det ind i gas-anæstesi kammer (2% Isofluran gas i O _2).
   3. Sluk for gassen anæstesi til kammeret og åbne anæstesi ventil og vakuum til IVIS manifolden. Umiddelbart placerer bedøvet dyrpå temperaturkontrollerede billedbehandling platform, og sørg for musens næsebor er korrekt placeret i gas-anæstesi manifolden. Det første billede skal tages cirka 5 minutter efter luciferin injektion. Op til 5 dyr kan afbildes på én gang i IVIS Spectrum instrument. Hvis mindre end 5 dyr, der skal afbildes, er det muligt at tilslutte den ubrugte manifold (r) for at spare på isofluran gas.
   4. Fortsæt med at tage billeder hvert 3 minut ved at oprette en sekvens på op til en time til at generere en kinetisk kurve for luciferin udtryk.
      1. Klik på [Sequence Setup] knappen i kontrolpanelet.
      2. Rækkefølgen editor vises.
      3. I kontrolpanelet, skal du angive indstillingerne for den første bioluminiscerende billede i sekvensen.
         1. Vi anbefaler at starte med Medium Binning.
         2. Vi anbefaler også Auto-eksponering for at afgøre den optimale eksponeringstid.
         3. Vælg [Interval] knappen i rækkefølge editor ennd angive en forsinkelse på 3 minutter mellem hver erhvervelse.
      4. Klik på [Tilføj] i den rækkefølge editor. Erhvervelse parametre er derefter tilføjes i tabellen.
      5. Gentag trin 4 for hvert billede i sekvensen.
   5. Når kurven er etableret, kan den optimale billeddiagnostiske tid afgøres ved at plotte signalstyrken (intensitet) mod tiden. Billede dyr på tidspunktet for højeste in vivo foton count for at få de stærkeste og mest præcise signal.
5. Tidlige eksperimenter bruges intraperitoneal (ip) injektion af luciferin dog, ip injektioner undertiden givet intermitterende resultater, der viser lidt at ingen bioluminescens i svulsten. Vi antager, at den lejlighedsvise tilfældige manglende signal skyldtes levering af luciferin til tarm eller andre indre organer. Vi begyndte derfor at bruge subkutan (sc) luciferin injektioner og så større imaging reproducerbarhed [Figur 3].
6. Tyveminutter efter sc injektion, dyrene er bedøvede ved at placere dem i et kammer med 2% isofluran gas i O _2, indtil de er afvisende.
7. Den bedøvede dyr (e) er flyttet til billeddannelse kammeret. Oftalmologiske salve bør anvendes til den kinetiske studiet på grund af længden af ​​billeddata. Det er ikke nødvendigt for de øvrige billeddiagnostiske procedurer, fordi de er korte i varighed.
8. Billedet er erhvervet ved middel binning med en 5 minutters eksponeringstid. Den automatiske købet mulighed kan også bruges.
9. Hvis signalet er mættet, og / eller besvimer ved middel binning, kan binning eller eksponeringstid justeres.
10. Programmet filer og efterfølgende billede kommentarer gemmes i brugerens computer bibliotek.

5. 3D Imaging ³

1. Klik på [Imaging Wizard] fanen i [Sequence Setup] vinduet på kontrolpanelet.
2. Vælg [bioluminescens] billedbehandlingstype på Imaging Guiden starter skærmen og CLick [Næste].
3. I "bioluminescens - DLIT" vindue af imaging guiden, skal du vælge [Firefly] reporter sonde. Emissionen / excitation af den valgte ildflue kilde spektrum vises med de seks pågældende filter valg, der skal erhverves.
4. Den sidste vises med standard valg, der omfatter automatisk eksponering erhvervelse parametre og en af ​​Field of View C. Standardindstillinger arbejde meget godt, men kan disse indstillinger ændres, hvis det er nødvendigt.
5. Klik på [Next] og sekvensen editor-vinduet vil blive befolket med sekvens af seks spektrale regioner på 20 nm bredt filtre (560 nm, 580 nm, 600nm, 620 nm, 640 nm, og 660nM). Tryk på [Acquire Sequence]. Det første filter (560 nm) vil omfatte en struktureret lys mønster ved hjælp af en laser galvanometer at etablere overflade topografi.
6. Vælg [overfladetopografi] fanen i Tool Palette. Surface udjævning kan anvendes for at tage højde for eventuelle skarpe vinkler oprettet under genopbygningsprocessen. Denstandard lav udjævning anbefales.
7. Klik på [Opret] og tomografi analyse boks vil dukke op. Tegn en afgrøde boks, der omfatter hele dyret, og klik derefter på [Næste].
8. Tærsklen Værktøjet vil fremstå som en lilla maske over det valgte område. Masken skal automatisk sættes til at matche foto af dyret. Om nødvendigt justeres tærsklen af ​​masken til mere passende passe omridset af dyret.
9. Klik på [Finish] og den rekonstruerede mesh vises. Rekonstruktionen kan derefter gemmes i resultaterne fanen.
10. Efter etableringen af ​​dyrets overflade topografi, til [DLIT 3D Genopbygning] fortsæt falde ned på værktøjspaletten.
11. Under [Analyser] Vælg fanen alle seks bølgelængder til at udføre genopbygningen. Fravælge billeder, der gav mættet pixels eller tæller under 600. Lad indstillingerne i [Parametre] fanen som standard.
12. Under [Properties] fanen bør "Muscle" være angivet som standard valg forr Tissue Egenskaber, og "Firefly" bør anføres som kilde spektrum.
13. Klik på [Genopbygning] under Analyser fanen, og 3D-rekonstruktion af dyrets overflade og den tilsvarende rekonstruktion af signalkilden skal vises [Figur 4].
14. Til at bestemme signalet placering og intensitet, skal du vælge voxels knappen på 3D-værktøjer under fanen Tool Palette.
    1. Tegn en firkant rundt om alle viste voxels og den samlede flux målinger vises i bunden af ​​fanen Lydstyrke.
    2. Klik på [Center of Mass] for at identificere signalet placeringen af ​​det valgte voxels. Koronale, sagittal og transaksial skiver af dyret vil blive vist, og ved hjælp af [Measurement Markør Display] afstanden fra dyrets overflade til voxel centrum kan måles.
15. Der henvises til levende billede softwarebrugsanvisningen Manual for yderligere oplysninger om co-registrering af orgel atlas og andre avancerede funktioner.

6. Data ANALYSE ³

1. Når billedet er købt og gemt, få adgang til programmet filen ved at klikke på [Browse] knappen og vælge filen.
2. Billedet oplysninger kan findes under [View] → [Billede Information].
3. Intensiteten af ​​signalet kan kvantificeres ved at vælge Region Of Interest (ROI) [ROI Tools] knappen. Sørg for, at billedet er analyseret under [Foton]-mode ved at vælge "Photon" på drop-down listen i øverste venstre hjørne af billedet kontrolpanelet.
4. Vælg [Measurement ROI] knappen fra "Type" drop-down listen. Vælg den ROI form af interesse; muligheder omfatter Cirkel, Firkant, og eller Gitter. Dækker alle områder af intensitet for den erhvervede billede.
5. Den ROI position indstilles ved at trække ROI formen markeringen til region, der indeholder bioluminiscerende signal.
6. Signalet intensiteten af ​​ROI er beregnet ved at klikke på [Mål] ​​knappen. Den ROI etiketten viser intensitet. ROI er kan styres og gemmes USIng det levende billede softwaren.

7. Repræsentative resultater:

Vellykket celle implantation er indlysende, når implanteres celler kan påvises ved hjælp af IVIS spektrum på dagen for operationen. Både GL261-Luc og GL261-luc2 celler kan måles, dog vil luc2 genet giver en højere grad af bioluminescens [Figur 5]. Billeder taget kort efter implantation kan have ikke-specifikke signalering på dyrets poter og næse, der bør ses bort som baggrund. Signal placeret på implantationsstedet er reel, og signalet vil stige med tiden [Figur 6]. Faldet i signalintensitet på dag 6 er reproducerbar og mest sandsynligt på grund af tab af tumor tage fra nogle af de implanterede celler. Kvantitative målinger af tumorbyrde er reproducerbare, at de bør stige støt indtil dyret sidste ende bukker under for sygdommen. Dog vil vækstkurver i høj grad afhænge af den tilstand af implanterede celler, og eller uundgåelige mindre var iability i implantation procedure. Vores laboratorium har valgt at billedet indopereret dyr hver tredje dag.

Figur 1. Når musen er korrekt bedøvet, er det placeret i stereotaktisk ramme. Musen Hovedet er sikret ved hjælp af mund klemme.

Figur 2. Når huden er åbnet de vigtigste anatomiske landemærker er identificeret herunder bl.a. bregma, den koronale og sagittale suturer. Den burrhole er lavet 2,3 mm til højre for bregma ved langsomt at dreje en 16 gauge 1 ½ tomme nål med en lille mængde af tryk, indtil kraniet er trængt ind og hjernen er udsat for.

Figur 3. En kinetiske sammenligning af subkutan (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg "alt =" Figure3.1 "/>) versus intraperitoneal ( ) Luciferin injektion blev udført for at demonstrere nytten af ​​en subkutan luciferin indsprøjtning og til at identificere det optimale tidspunkt at billedet efter luciferin administration. Tre minutter efter luciferin blev injiceret i mus blev bedøvet, placeret i IVIS Spectrum instrument og filmede hver 3 minutter til op til en time og hver 6 minutter efter, at for at generere en kinetisk kurve bioluminescens. Dette viste, at en subkutan luciferin administration var overlegen i forhold til en intraperitoneal injektion i vores hænder, og at det optimale tidspunkt til billede dyrene blev cirka 25 minutter efter luciferin injektion GL261-Luc celler blev brugt.

Figur 4. Flere visninger af et 3-Dimensional reconstruction af intrakranielle implantation af GL261-luc2 celler co-registreret med musen skelettet og hjernen.

Figur 5. Photon tæller fra tumorer skyldes GL261-Luc celler vs GL261-luc2 celler. Resultaterne er et gennemsnit af 5 dyr.

Figur 6. Graf for GL261-Luc tumorcellevækst i en albino C57BL / 6 mus. Bioluminescens blev målt hver 3 dage, og plottet som in vivo foton tæller versus dage efter implantation. Fotografier viser bioluminescens på forskellige tidspunkter. Farve er en indikation af bioluminescens (pixel intensitet), som er i forhold til tumor celle nummer (farve bar er vist til højre). Efter, at dyret bukket under for sygdommen i hjernen var dissekeret og luciferin blev tilføjet lokalt at få ex vivo image er vist i figuren indsatte.

Discussion

Cellen inokulum er infunderes med en dybde på 2,6 mm fra overfladen af ​​hjernen efter oprettelse af en 0,4 mm lomme. For at sikre korrekt placering og dybde af nåle-en X-ray kan tages ved hjælp af en C-arm eller lignende X-ray billede intensivering enhed, men dette er valgfrit. Komplikationer til operationen kan opstå, hvis dyret ikke er korrekt bedøvet, hvorefter dyret kan bevæge sig under celle infusion. Dette kan medføre lækage af celle-mix eller blødning fra nålen spor. Udsivning af celler årsager uden for livmoderen væksten af ​​tumorceller. Det er også vigtigt ikke at punktere hjertekammer, der kan gøres, hvis burrhole sker mediale til 2,3 mm, der er beskrevet i protokollen ^4. Korrekt placering af kanylen og cellen var spændet testet af infusion af en mus med 2 μl methylenblåt farvestof og dissekere hjernen væv til at kontrollere placeringen af ​​infunderes farvestof.

I denne protokol, har vi brugt IVIS Spectrum in vivo imaging system og tHan Living Billede software (v 4,0) designet til brug med dette instrument. (Caliper Life Sciences). Enhver sammenlignelige in vivo imaging system og billedanalyse værktøjer kan bruges til at opnå lignende resultater. Disse systemer giver nogle fordele frem for traditionelle magnetisk resonans imaging (MRI) til at følge væksten af ​​en eksperimentel intrakraniel tumor. Den mest indlysende er de relative omkostninger ved de 2 instrumenter - dyr MRI maskiner er langt dyrere og typisk få brug for en dygtig MRI tekniker. In vivo imaging, såsom hvad der blev beskrevet her kan gøres ved at slutbrugeren. Den bioluminescens data er kvantitative, mens kvantificering af MRI data er tidskrævende og noget upræcist. Desuden MR billeder viser ødem og inflammation i tillæg til tumorceller, og det kan være svært at adskille tumor fra behandlingseffekt. Af disse grunde at få nøjagtige volumetriske målinger af voksende tumor kan være en udfordring. Bioluminescens kræver ATP, Derfor kun levende tumorceller bidrage til tumorstørrelse data. På trods af dette, er der nogle fordele ved at MR-scanning, hvis en maskine er tilgængelig. Celler behøver ikke at være mærket med en selvlysende markør at blive visualiseret ved MR-scanning. Evnen til at visualisere peri-svulstsygdomme ødem kan være en fordel for nogle forsøgsprotokoller. En styrke begge teknologier er, at ved hjælp af en ikke udelukker anvendelsen af ​​andre, så data kan hentes på væksten af ​​tumor samt tilstedeværelsen af ​​peri-svulstsygdomme ødem og betændelse fra det samme dyr, når begge teknologier er tilgængelige til forskeren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GL261-luc2 Bioware Ultra	Caliper Life Sciences	GL261-luc2
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	10313039
Geneticin (G418)	GIBCO, by Life Technologies	11811-023
Fetal Calf Serum (FCS)	Invitrogen	26140079
Phospate Buffered Saline (PBS)	Invitrogen	70011044
C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr Mice	National Cancer Institute
AKWA Tears Lubricant Opthalmic Ointment	Akorn Inc	17478-062-35
Ketaset (ketamine hydrochloride)	Wyeth Animal Health	11570775
Sedazine (xylazine hydrochloride)	Wyeth Animal Health	10031894
Small Animal Stereotaxic Instrument	Kopf Instruments	900
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1	If not available, it is possible to infuse manually
10μl syringe with 26 gauge beveled needle	World Precision Instruments, Inc.	SGE010RNS
Adison Forceps	World Precision Instruments, Inc.	500092
Penfield Dissector	Codman	65-1015
16g 1½ Precision Glide Needle	BD Biosciences	305198
Surgical Blade Handle	BD Biosciences	371030
Size 15 Blade	BD Biosciences	371315
4-0 Vicryl Suture	Ethicon Inc.	VCP496G
Bone Wax	Medline Industries	DYNJBW25
Povidine-Iodine Swab Sticks	Medline Industries	MD93901
D-Luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	122796
Forane (Isoflurane)	Baxter Internationl Inc.	1001936060
OPMI Pentero Microscope	Carl Zeiss, Inc.		Any surgical microscope will suffice
Xenogen IVIS Spectrum with optional anesthesia system	Caliper Life Sciences