Stretching korte sequenties van DNA met Constant Force Axiale optisch pincet
Summary
Wordt het gebruik van een constante kracht axiaal optische pincetten om de mechanische eigenschappen van korte DNA moleculen te verkennen. Door stretching DNA axiaal, minimaliseren we sterische hindernissen en artefacten die in conventionele laterale manipulatie, waardoor we DNA-moleculen te bestuderen zo kort ~ 100 nm.
Abstract
Single-molecule technieken voor stretching DNA van contour lengte minder dan een kilobase zijn beladen met experimentele moeilijkheden. Veel interessante biologische gebeurtenissen zoals histon binding en eiwit gemedieerde DNA looping van 1,2, later op deze lengteschaal. In de afgelopen jaren zijn de mechanische eigenschappen van DNA aangetoond een belangrijke rol te spelen in fundamentele cellulaire processen zoals de verpakking van DNA in nucleosomen en compact chromatinevezels 3,4. Duidelijk is dan belangrijk om de mechanische eigenschappen van korte stukjes DNA. In dit artikel geven we een praktische gids voor een single-molecule optische pincet techniek die we hebben ontwikkeld om het mechanisch gedrag van DNA met contour lengtes zo kort als een paar honderd baseparen te bestuderen.
De belangrijkste hindernis in rekken korte segmenten van DNA is dat de conventionele optische pincetten zijn over het algemeen ontworpen om kracht uit te oefenen in een direction lateraal van het podium 5,6, (zie Fig. 1). In deze geometrie de hoek tussen de hiel en het dekglaasje, waaraan het DNA wordt vastgemaakt, wordt erg hoog voor submicron lengte DNA. De axiale positie moet nu rekening worden gehouden, dat kan een uitdaging zijn, en aangezien de uitbreiding sleept de microsfeer dichter bij de dekglaasje, sterische effecten worden versterkt. Bovendien als gevolg van de asymmetrie van de microsferen zal zijdelingse verlengingen genereren verschillende niveaus koppel door rotatie van de microsfeer in de optische val aangezien de richting van de reactiekracht veranderingen tijdens de extensie.
Alternatieve methoden voor het strekken submicron DNA oplopen tegen hun eigen unieke hindernissen. Zo is een dual-beam optische val beperkt tot rekken DNA van ongeveer een golflengte, waarna interferentie tussen de twee trappen en van lichtverstrooiing tussen de microsferen beginnen een groot probleem vormen. Vervangen van een trapsmet een micropipet hoogstwaarschijnlijk lijden soortgelijke uitdagingen. Men zou rechtstreeks het axiale potentieel om de DNA rekken, een actieve feedback regeling nodig zijn om een constante kracht en de bandbreedte hiervan zeer beperkt, met name bij lage uitgeoefend.
We omzeilen deze fundamentele problemen door direct te trekken van het DNA uit de buurt van het dekglaasje met behulp van een constante kracht axiale optisch pincet 7,8. Dit wordt bereikt door het vangen van de kraal in een lineair gebied van de optische mogelijkheden, waarbij de optische kracht constante waarvan de sterkte kan worden geregeld door het laservermogen. Vangen binnen het lineaire gebied vormt ook alle optische kracht-klem op de DNA dat zich bijna 350 nm in axiale richting. We gelijktijdig compenseren voor thermische en mechanische drift van fijn instellen van de positie van het werkgebied zodat een verwijzing microsfeer vast aan het dekglaasje blijft op dezelfde positie en focus, eenllowing voor een vrijwel onbeperkte observatieperiode.
Protocol
Discussion
Conventionele optische pincetten vertrouwen op analoge of computergestuurde feedback om een constante kracht op refractiele object. Deze actieve feedback systemen moeilijk voeren onder omstandigheden waarbij plotselinge veranderingen in de verlenging van het monster optreden, bijvoorbeeld van de binding van een eiwit aan DNA of de snelle intensivering van een moleculaire motor langs een filament. Diverse passieve methoden voor de toepassing van constante krachten zijn recentelijk ontwikkeld. Een methode gebruikt o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr Yih-Fan Chen voor hulp bij de axiale optisch pincet en om bij te dragen sommige van zijn stretching gegevens om dit manuscript. Dit werk werd gesponsord door NSF subsidie PHY-0957293 en FOCUS subsidie PHY-0114336.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| Nd:YVO4 laser | Spectra Physics | T40-Z-106C | |
| Acousto-optic deflector |
IntraAction | DTD-274HA6 | |
| Microscope Objective | Olympus | PlanApo | 60X, NA 1.4 |
| Piezo stage | Mad City Labs | Nano-LP100 | XYZ stage |
| CCD camera | PixeLink | PL-A741 | |
| Photodetector | Electro-Optics Tech |
ET-3020 | |
| Polystyrene Beads | Spherotech | SVP-08-10 | 800nm, streptavidin coated |
| Anti-digoxigenin | Roche | 11333089001 | From sheep |
| Primers | MWG operon | Custom oligos | One primer: biotin Other : digoxigenin |
| PCR reagents | New England Biolabs |
TAQ polymerase, dNTPs |
|
| Coverglass | Fisher Scientific | ||
| Other chemicals for buffer |
Fisher Scientific |
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction Coefficient
For determining the hydrodynamic friction coefficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction coefficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere’s center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an “effective” persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11
where ε is the relative DNA extension.
Referências
- Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. Enzyme-mediated DNA looping. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).
- Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches. Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).
- Kaplan, N. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Garcia, H. G. Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2006).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).
- Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers. Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).
- Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules. Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).
- Chen, Y. F., Chu, M. Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol. Meiners Lab. , (2011).
- Brenner, H. The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface. Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase. Science. 313, 801-801 (2006).
- Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment. Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).
- Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops. Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).
- Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules. , (2011).
