Alongamento curtas seqüências de DNA com Pinça força constante óptico axial

Summary

Ilustramos o uso de uma constante de força axial pinças ópticas para explorar as propriedades mecânicas das moléculas de ADN curtas. Esticando DNA axialmente, minimizamos impedimento estérico e artefatos provenientes de manipulação laterais convencional, o que nos permite estudar moléculas de DNA tão curto quanto ~ 100 nm.

Abstract

Molécula única de técnicas de alongamento de ADN de comprimentos de contorno inferior a uma kilobase estão repletas de dificuldades experimentais. No entanto, muitos interessantes eventos biológicos tais como a ligação histona e proteínas mediada por looping de ADN ^{a 1,2,} ocorrem nesta escala de comprimento. Nos últimos anos, as propriedades mecânicas do ADN têm sido mostrados para desempenhar um papel importante em processos celulares fundamentais como a embalagem do ADN em nucleossomas compactos e fibras de cromatina ^3,4. Claramente, é então importante compreender as propriedades mecânicas dos trechos curtos de DNA. Neste artigo, apresentamos um guia prático para uma técnica de uma única molécula de óptica tweezing que temos desenvolvido para estudar o comportamento mecânico de DNA com comprimentos de contorno tão curtos quanto a algumas centenas de pares de bases.

O grande obstáculo no alongamento pequenos segmentos de DNA é que convencionais pinças ópticas são geralmente projetados para aplicar a força em um direction lateral ao estágio ^5,6, (ver fig. 1). Nesta geometria, o ângulo entre o rebordo e as lamelas, para o qual o DNA é presa, torna-se muito íngremes para submicron DNA comprimento. A posição axial deve agora ser considerado, que pode ser um desafio, e, uma vez que a extensão da microesfera arrasta mais perto da lamela, efeitos estéricos são melhoradas. Além disso, como resultado da assimetria das microesferas, as extensões laterais irá gerar vários níveis de binário devido à rotação da microesfera no interior da armadilha óptica uma vez que a direcção das variações de força reactiva durante a extensão.

Métodos alternativos para DNA submicron alongamento correr até contra seus próprios obstáculos únicos. Por exemplo, uma armadilha de duplo feixe óptico é limitada ao estiramento DNA de cerca de um comprimento de onda, em que os efeitos de interferência entre os pontos de duas armadilhas e de dispersão da luz entre as microsferas começam a ser um problema significativo. Substituindo uma das armadilhascom uma micropipeta provavelmente sofrem de desafios semelhantes. Embora se possa utilizar directamente o potencial axial para alongar o DNA, um esquema de feedback ativo que seria necessário para aplicar uma força constante e a largura de banda que será bastante limitado, especialmente em baixas forças.

Nós contornar esses problemas fundamentais diretamente puxando o DNA de distância da lamínula usando uma força constante axial pinças ópticas ^7,8. Isto é conseguido prendendo o grânulo em uma região linear do potencial óptico, em que a força óptica é constante, a força que pode ser ajustada através do ajuste da potência do laser. Prendendo dentro da região linear também serve como um todo óptico força de fixação sobre o ADN que se estende por cerca de 350 nm no sentido axial. Nós simultaneamente compensar o desvio térmico e mecânico com a ajustar com precisão a posição da fase de modo a que uma microesfera referência preso à lamela permanece na mesma posição e foco, umllowing para um período de observação de praticamente ilimitadas.

Protocol

1. Pinças Setup O feixe de um laser 1064 nm é dividida em dois feixes polarizados ortogonalmente. Um é utilizado para manipular a biomolécula, enquanto o outro é usado para fins de calibração (ver a Fig. 2.). A intensidade do feixe de manipulação é controlada por um deflector acústico-óptico (AOD), enquanto que a posição de focagem e de cada feixe é controlada de forma independente por espelhos de feixe de direcção e telescópios ópticos, respectivamente. Os feixes são e…

Discussion

Pinças ópticas convencionais dependem tanto de feedback analógico ou controlado por computador para aplicar uma força constante sobre um objecto refrangente. Estes sistemas de retroalimentação activas têm dificuldade em realizar, em condições em que as alterações súbitas na extensão do espécime ocorrem, por exemplo, a partir da ligação de uma proteína ao ADN ou a intensificação rápida de um motor molecular ao longo de um filamento. Vários métodos para a aplicação de forças passivas constantes fo…

Materials

Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific

Supplementary Materials

A. Hydrodynamic Friction Coefficient

For determining the hydrodynamic friction coefficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion^5,10:

where the following shorthand has been introduced:

The friction coefficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere’s center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.

B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration

The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.

C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model

The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:

where F_opt is the optical force, x_o is a fit parameter for the zero force extension,x_opt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*_p is a second fit parameter for an “effective” persistence length. F_wlc is given by the usual WLC model¹¹

where ε is the relative DNA extension.