Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion
Summary
Models of Tumorzellinvasion in dreidimensionale extrazelluläre Matrix besser widerspiegeln<em> In vivo</em> Situation als zweidimensionale Beweglichkeit Assays. Mit Matrix-Invasion Assays mit konfokale Bildgebung von Fluoreszenz-markierten Zellen, detaillierte Informationen über die Invasion Modi und die einzelnen Beiträge zu den führenden im Vergleich zu folgenden Zellen kombiniert erreicht werden kann.
Abstract
Ein charakteristisches Merkmal von Krebs Malignität Invasion und Metastasierung 1. In einigen Krebsarten (e. g. Gliom 2), lokale Invasion in das umgebende gesunde Gewebe ist die Ursache von Krankheit und Tod. Für andere Krebsarten (e. g. Brust, Lunge, etc.), Wird der Prozess der Metastasierung ist, in die Tumorzellen von einem Primärtumor Masse zu bewegen, zu kolonisieren distalen Seiten und letztendlich zum Organversagen beitragen, dass führt schließlich zu Morbidität und Sterblichkeit 3. Es wurde geschätzt, dass der Invasion und Metastasierung verantwortlich für 90% der Krebstodesfälle 4 sind. Als Ergebnis gab es reges Interesse bei der Identifizierung der molekularen Prozesse und kritische Protein Mediatoren der Invasion und Metastasierung für die Zwecke der Verbesserung von Diagnose und Behandlung 5 gewesen.
Eine Herausforderung für Krebsforscher ist Invasionsassays hinreichend ähneln den in-vivo-Situation zu entwickelngenaue Krankheit Modellierung 6 zu ermöglichen. Zweidimensionale Zellmotilität Assays sind nur informativ über einen Aspekt der Invasion und berücksichtigen nicht die extrazelluläre Matrix (ECM)-Protein Umbau, die auch ein kritisches Element zu nehmen. In jüngster Zeit hat die Forschung unser Verständnis von Tumorzellinvasion verfeinert und gezeigt, dass einzelne Zellen kann durch längliche oder runde Modi 7 zu bewegen. Darüber hinaus hat es eine größere Wertschätzung des Beitrags der kollektiven Invasion in die Zellen eindringen in Stränge, Platten und Clustern, insbesondere in hoch differenzierten Tumoren, die epithelialen Eigenschaften beizubehalten, um die Ausbreitung von Krebs 8 wurden.
Wir präsentieren eine raffinierte Methode 9 für die Prüfung der Beiträge der Kandidaten-Proteine, um kollektive Invasion 10. Insbesondere durch technische separate Pools von Zellen auf verschiedene fluoreszierende Proteine exprimieren, ist es möglich, molekular sezieren die Aktivitäten und Proteins in führenden Zellen im Vergleich zu denen in folgenden Zellen erforderlich erforderlich. Die Verwendung von RNAi stellt die molekulare Werkzeug, um experimentell zu zerlegen die Prozesse in einzelne Zelle Invasion sowie in verschiedenen Positionen der kollektiven Invasion beteiligt. In diesem Verfahren, Mischungen von fluoreszenzmarkierten Zellen auf dem Boden eines Transwell einfügen zuvor mit Matrigel ECM-Protein gefüllt sind vernickelt, dann erlaubt, "nach oben" durch den Filter und in den Matrigel Invasion. Rekonstruktion der z-Serie Bildstapeln durch konfokale Bildgebung erhalten, in dreidimensionale Darstellungen ermöglicht Visualisierung von kollektiv eindringenden Stränge und Analyse der Darstellung von fluoreszenzmarkierten Zellen in führenden gegenüber folgenden Positionen.
Protocol
Discussion
Matrigel Invasion Assays wurden traditionell mit Zellen auf eine Schicht aus extrazellulären Matrix-Proteins mit Lockstoff-induzierten Motilität in Richtung und durch einen Filter am unteren Rand platziert gesetzt. Invasivität wurde als Funktion der, wie viele Zellen könnte auf der Unterseite des Filters gezählt werden gewertet. Obwohl praktisch gibt es kaum einen Unterschied mit dem "inverse" Invasion Assay beschrieben, gibt es wesentlich mehr Informationen über den Prozess der Invasion, die durch die V…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung dieser Forschung ist von Cancer Research UK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO | 21969 |
| Fetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO | 25050-032 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| 6.5mm Transwells, 8.0 µm pore size | Corning | 3422 |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 |
| RNase | Qiagen | 19101 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
| Confocal microcope | Leica | SP2MP |
Referências
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