Génération des cultures organotypiques de Raft kératinocytes humains primaires

Summary

Un<em> In vitro</em> La méthode pour imiter<em> In vivo</em> Différenciation épithéliale est décrite. De nombreux virus cibler les cellules épithéliales dans le cadre de leur cycle de vie virale, et cette méthode fournit un moyen d'examiner le virus: les interactions hôte-qui ressemble plus à ce qui se produit<em> In vivo</em>. Cette technique peut être utilisée avec des kératinocytes primaires, des lignées cellulaires établies, ainsi que la normale ou pathologique des tissus de biopsie.

Abstract

Le développement de cultures organotypiques radeau épithéliales a fourni aux chercheurs un système efficace dans le système in vitro qui reproduit fidèlement la différenciation épithéliale récapitule. Il ya beaucoup d'utilisations de ce système. Par exemple, la capacité de croître des cultures tridimensionnelles radeau organotypiques de kératinocytes a été un jalon important dans l'étude du virus du papillome humain (VPH) ^1. Le cycle de vie du VPH est étroitement liée à la différenciation de l'épithélium pavimenteux ^2. Organotypiques cultures radeau épithéliales comme démontré ici de reproduire le cycle de vie complet du virus du papillome, y compris la production de virus ^3,4,5. En outre, ces cultures présentent des lésions dysplasiques radeau similaires à ceux observés lors de l'infection de vivo par le VPH. Par conséquent ce système peut également être utilisée pour étudier les cancers des cellules épithéliales, ainsi que l'effet des drogues sur la différenciation des cellules épithéliales en général. Initialement développé par Asselineau et Prunieras <sjusqu'à> 6 et modifié par Kopan et al. ^7, le système épithélial organotypique culture radeau a mûri pour devenir un général, modèle de culture relativement facile, ce qui implique la croissance des cellules sur le collagène se branche maintenue à l'interface air-liquide (figure 1A). Au cours de 10-14 jours, les cellules de stratifier et de différencier, formant un épithélium sur toute son épaisseur qui produit la différenciation spécifiques cytokératines. Radeaux récoltées peuvent être examinés histologiquement, ainsi que par des techniques classiques moléculaires et biochimiques. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour la génération des cultures primaires de radeau des kératinocytes humains. La même technique peut être utilisée avec des lignées de cellules épithéliales, et peut facilement être adapté pour une utilisation avec du tissu épithélial à partir de biopsies normales ou malades ^8. De nombreux virus cibles soit l'épithélium cutané ou muqueux, dans le cadre de leur cycle de vie réplicative. Au cours des dernières années, la possibilité d'utiliser le culte radeau organotypiqueres comme une méthode d'étude des interactions virus-hôte cellulaire a été montré pour plusieurs virus de l'herpès, ainsi que les adénovirus, parvovirus, poxvirus et ^9. Cultures organotypiques radeau peut donc être adaptée afin d'examiner la pathogenèse virale, et sont les seuls moyens pour tester de nouveaux agents antiviraux pour les virus qui ne sont pas cultivables dans des lignées cellulaires permanentes.

Protocol

1. Préparation pour les cultures organotypiques Raft Les grilles métalliques radeau bien d'abord être traités avec de l'acide sulfurique chromique pour enlever tout résidu qui pourrait interférer avec le processus de différenciation. Immerger les grilles métalliques dans un récipient en verre contenant de l'acide sulfurique pendant une heure, puis de façon continue rincés pendant la nuit avec l'eau du robinet. Après la nuit de rinçage, les grilles de radeau doit être rincé penda…

Discussion

Nous décrivons ici une méthode qui peut être utilisé pour étudier la différenciation épithéliale en général, mais peut également être facilement adapté pour étudier la pathogenèse virale, ainsi que l'efficacité de traitements potentiels. De nombreux virus cibler les cellules épithéliales, soit que le site primaire de l'infection, comme dans le cas du VPH, ou à un certain moment dans le cycle de vie du virus, comme avec des herpèsvirus. Bien que de plus en plus les cultures organotypiques rade…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalog number
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010