Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

Summary

Um<em> In vitro</em> Método para simular<em> In vivo</em> Diferenciação epitelial é descrito. Muitos vírus alvo células epiteliais, como parte do seu ciclo de vida do vírus, e este método proporciona um meio de análise de vírus: interacções hospedeiras que mais se assemelha a que ocorre<em> In vivo</em>. Esta técnica pode ser usada com queratinócitos primários, linhas celulares estabelecidas, bem como normais ou doentes de tecidos de biópsia.

Abstract

O desenvolvimento de culturas organotípicas de jangada epiteliais forneceu investigadores com um eficiente sistema de vitro que fielmente diferenciação recapitula epitelial. Há muitos usos para esse sistema. Por exemplo, a capacidade de crescer tridimensionais culturas organotípicas de jangada de queratinócitos foi um passo importante no estudo do papilomavírus humano (HPV) ^1. O ciclo de vida de HPV é rigidamente ligada à diferenciação de epitélio escamoso ^2. Organotípicas culturas jangada epiteliais como demonstrado aqui reproduzir o ciclo de vida papilomavírus, incluindo a produção de vírus ^3,4,5. Além disso, estas culturas jangada exibem lesões displásicas semelhantes aos observados após infecção de vivo com HPV. Assim, o presente sistema pode também ser usado para estudar cancros de células epiteliais, bem como o efeito de drogas na diferenciação de células epiteliais em geral. Originalmente desenvolvido pela Asselineau e Prunieras <sup> 6 e modificado por Kopan et al. ^7, o sistema de cultura organotípico epitelial jangada amadureceu em geral um modelo de cultura, relativamente fácil, o qual envolve o crescimento de células em colagénio liga mantida a uma interface ar-líquido (Figura 1A). Ao longo de 10-14 dias, as células estratificar e diferenciar, formando um epitélio espessura total que produz-diferenciação específicos citoqueratinas. Jangadas colhidas pode ser examinado histologicamente, bem como por técnicas padrão de moleculares e bioquímicos. Neste artigo, é descrito um método para a geração de culturas primárias de jangada de queratinócitos humanos. A mesma técnica pode ser usada com estabelecidas linhas de células epiteliais, e pode facilmente ser adaptado para uso com o tecido epitelial a partir de biópsias normais ou doentes ^8. Muitos vírus alvo tanto o epitélio cutâneo ou da mucosa, como parte de seu ciclo de vida replicativo. Ao longo dos últimos anos, a viabilidade do uso culto jangada organotípicoUres como um método de estudo das interacções vírus-hospedeiro de células tem sido demonstrado para herpesvírus vários, bem como adenovírus, parvovírus, e poxvírus ^9. Culturas organotípicas de jangada pode assim ser adaptado para examinar patogénese virai, e são os únicos meios para testar novos agentes antivirais para aqueles vírus que não são cultiváveis ​​em linhas de células permanentes.

Protocol

1. Preparação para culturas Jangada organotípicas As grelhas de jangada de metal muito primeiro ser tratados com ácido sulfúrico crómico para remover qualquer resíduo que poderia interferir com o processo de diferenciação. Grelhas de metal imergir em um copo de vidro contendo ácido sulfúrico durante uma hora, em seguida, lavado continuamente durante a noite com água da torneira. Após o enxaguamento durante a noite, as grades de jangada deve ser lavado durante 3-5 horas em água destilada duas vez…

Discussion

Descrevemos aqui um método que pode ser usado para estudar a diferenciação epitelial em geral, mas também pode ser facilmente adaptado para estudar patogénese virai, bem como a eficácia da terapêutica potencial. Muitos vírus alvo células epiteliais, quer como o principal local de infecção, como no caso de HPV, ou em algum ponto do ciclo de vida do vírus, tal como com herpesvírus. Embora crescente culturas jangada organotípicas é demorado, a habilidade de recapitular fielmente na diferenciação e…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalog number
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010