Method Article

Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

DOI:

10.3791/3668

February 22nd, 2012

In This Article

Summary

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Um In vitro Método para simular In vivo Diferenciação epitelial é descrito. Muitos vírus alvo células epiteliais, como parte do seu ciclo de vida do vírus, e este método proporciona um meio de análise de vírus: interacções hospedeiras que mais se assemelha a que ocorre In vivo. Esta técnica pode ser usada com queratinócitos primários, linhas celulares estabelecidas, bem como normais ou doentes de tecidos de biópsia.

Abstract

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O desenvolvimento de culturas organotípicas de jangada epiteliais forneceu investigadores com um eficiente sistema in vitro que fielmente diferenciação recapitula epitelial. Há muitos usos para esse sistema. Por exemplo, a capacidade de crescer tridimensionais culturas organotípicas de jangada de queratinócitos foi um passo importante no estudo do papilomavírus humano (HPV) 1. O ciclo de vida de HPV é rigidamente ligada à diferenciação de epitélio escamoso 2. Organotípicas culturas jangada epiteliais como demonstrado aqui reproduzir o ciclo de vida papilomavírus, incluindo a produção de vírus 3,4,5. Além disso, estas culturas jangada exibem lesões displásicas semelhantes aos observados após infecção in vivo com HPV. Assim, o presente sistema pode também ser usado para estudar cancros de células epiteliais, bem como o efeito de drogas na diferenciação de células epiteliais em geral. Originalmente desenvolvido pela Asselineau e Prunieras et al. 7, o sistema de cultura organotípico epitelial jangada amadureceu em geral um modelo de cultura, relativamente fácil, o qual envolve o crescimento de células em colagénio liga mantida a uma interface ar-líquido (Figura 1A). Ao longo de 10-14 dias, as células estratificar e diferenciar, formando um epitélio espessura total que produz-diferenciação específicos citoqueratinas. Jangadas colhidas pode ser examinado histologicamente, bem como por técnicas padrão de moleculares e bioquímicos. Neste artigo, é descrito um método para a geração de culturas primárias de jangada de queratinócitos humanos. A mesma técnica pode ser usada com estabelecidas linhas de células epiteliais, e pode facilmente ser adaptado para uso com o tecido epitelial a partir de biópsias normais ou doentes 8. Muitos vírus alvo tanto o epitélio cutâneo ou da mucosa, como parte de seu ciclo de vida replicativo. Ao longo dos últimos anos, a viabilidade do uso culto jangada organotípicoUres como um método de estudo das interacções vírus-hospedeiro de células tem sido demonstrado para herpesvírus vários, bem como adenovírus, parvovírus, e poxvírus 9. Culturas organotípicas de jangada pode assim ser adaptado para examinar patogénese virai, e são os únicos meios para testar novos agentes antivirais para aqueles vírus que não são cultiváveis ​​em linhas de células permanentes.

Protocol

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1. Preparação para culturas Jangada organotípicas

  1. As grelhas de jangada de metal muito primeiro ser tratados com ácido sulfúrico crómico para remover qualquer resíduo que poderia interferir com o processo de diferenciação. Grelhas de metal imergir em um copo de vidro contendo ácido sulfúrico durante uma hora, em seguida, lavado continuamente durante a noite com água da torneira. Após o enxaguamento durante a noite, as grades de jangada deve ser lavado durante 3-5 horas em água destilada duas vezes.
  2. Para fornecer suporte para as jangadas, dobre três lados da jangada cerca de 0,5 cm a igual distância uns dos outros. As grelhas de metal deve então s....

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Discussion

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Descrevemos aqui um método que pode ser usado para estudar a diferenciação epitelial em geral, mas também pode ser facilmente adaptado para estudar patogénese virai, bem como a eficácia da terapêutica potencial. Muitos vírus alvo células epiteliais, quer como o principal local de infecção, como no caso de HPV, ou em algum ponto do ciclo de vida do vírus, tal como com herpesvírus. Embora crescente culturas jangada organotípicas é demorado, a habilidade de recapitular fielmente na diferenciação epitelial vivo.......

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Disclosures

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Não temos nada a divulgar.

Acknowledgements

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Os autores gostariam de agradecer a Sally Roberts (University of Birmingham, Birmingham Reino Unido) para a dom tipo do anticorpo E1E4. Este trabalho foi financiado por uma concessão do Instituto Nacional do Câncer (4R00CA137160-03).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nome do Reagente Companhia Número de Catálogo
Rato O colágeno tipo cauda 1 (4-5mg/ml) BD Biosciences 354236
DMEM sem niveis de NaHC0 3 Invitrogen 12100-061
3 niveis de NaHC0 Sigma S5761
Hepes Calbiochem 391338
Grades metálicas de aço inoxidável Williams e Mettle Co. CR-03063-040-100-S
E média 11
Fator de Crescimento Epidérmico BD Biosciences 354010

References

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  1. Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
  2. Asselineau, D., Prunieras, M.

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Organotypic Raft CulturesPrimary Human KeratinocytesAir Liquid InterfaceCollagen PlugsEpithelial DifferentiationHistological AnalysisImmunohistochemical AnalysisHuman PapillomavirusVirus Host InteractionsEpithelial Cell Lines

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