の植民地化 Euprymna scolopesイカでビブリオフィシャリ</em
Summary
メソッドは、ハワイアンボブテイルイカ手順を概説<em> Euprymna scolopes</em>とその共生細菌、<em>ビブリオフィシャリ</em>別々に調達し、細菌によってイカの光器官の特定の植民地化を可能にするために導入されています。細菌由来の発光によって、ダイレクトコロニーカウントによって植民地化の検出は、記載されています。
Abstract
特定の細菌は、動物の組織1-5アソシエーションに記載されています。このようなホストベースの細菌アソシエーション（共生）、（病原性）有害であるなしフィットネスセンター結果（共生）を持っていない、または（相利共生）有益であることができます。注目は、病原体の相互作用に与えてきたが、少しは環境からの有益な/共生細菌の再現性の買収を決定するプロセスについて知られています。海洋グラム陰性菌の間に光臓器共生V.シャリとハワイボブテイルイカ、E. scolopesは 、1つのホスト（E. scolopes）は、その生涯6,7の過程を通じて一細菌種（V.シャリ ）との共生関係を確立するには高度に特異的な相互作用を表しています。 V.によって生成された生物発光この相互作用中にシャリは大腸菌に抗捕食性の利点を提供しています夜行性の活動中scolopesながら8,9、栄養豊富な宿主組織を提供しますV.保護されたニッチ10とシャリ 。各ホストの生成時に、この関係は、このように共生発展のさまざまな段階で詳細に評価することができる予測可能なプロセスを表す、recapitulatedされています。研究室では、少年イカハッチaposymbiotically（uncolonized）、および、最初の30-60分以内に収集され、シンビオント-free水に転送する場合には、実験的な接種6による場合を除いて植民地化することはできません。この相互作用は、このように環境11,12から共生微生物の具体的な買収につながる個々のステップを評価するためにする有用なモデルシステムを提供します。
ここでは、新たにaposymbiotic E.孵化したときに発生し植民地化の程度を評価する方法について説明します。 scolopesは含まれている（人工）海水にさらされているV.シャリ。このシンプルなアッセイは、予防接種、自然感染、およびリカバリについて説明します。E.の初期の光の臓器から共生細菌のscolopes。ケアは特に水質と光の合図に関しては、共生の開発中に動物のための一貫性のある環境を提供するために取られます。説明した共生の人口を特徴付けるための方法は、細菌由来の生物発光の（1）測定、回収共生のカウント（2）ダイレクトコロニーが含まれています。
Protocol
Discussion
説明され植民地化アッセイは、制御された実験室環境での自然共生プロセスの分析が可能になります。このように、それは異なった自然の菌株によって、さまざまな化学物質制度の下で、変異株によるコロニー形成を評価するために使用することができます。記載の実験のバリエーションは、一般的に共生の異なる側面を評価するために使用されています。植民地化の動力学は、一致検出器?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、イカ施設をサポートするために、この原稿についてのコメント、マイケル·ハドフィールドとフィールドのコレクションの間に援助のケワロ海洋研究所およびこのプロトコルへの貢献のために、Rubyとマクフォール·ガイ研究所のメンバーのGyllborgマティアスに感謝します。マンデル研究所での作業は、NSF IOS-0843633によってサポートされています。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
Referências
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