Summary

Colonização de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri</em

Published: March 01, 2012
doi:

Summary

O método descreve o procedimento pelo qual o squid bobtail havaiana,<em> Euprymna scolopes</em> E seu simbionte bacteriano,<em> Vibrio fischeri</em>, São levantadas separadamente e, em seguida, introduzido para permitir a colonização específica do órgão luz lula pelas bactérias. Detecção de colonização por bactérias luminescência e derivados por meio de contagem direta colônia são descritas.

Abstract

Bactérias específicas são encontrados em associação com tecidos animais 1-5. Tais host-bacterianas associações (simbiose) pode ser prejudicial (patogênicos), não tem conseqüência fitness (comensal), ou ser benéfica (mutualismo). Enquanto muita atenção tem sido dada às interações patogênicas, pouco se sabe sobre os processos que determinam a aquisição reprodutível de benéficos / comensal bactérias do ambiente. O mutualismo luz de órgãos entre a bactéria Gram-negativa marinha V. fischeri eo havaiano bobtail lula, E. scolopes, representa uma interação altamente específica em que um host (E. scolopes) estabelece uma relação simbiótica com apenas uma espécie bacteriana (V. fischeri) durante todo o curso da sua vida 6,7. A bioluminescência produzido por V. fischeri durante essa interação fornece um benefício anti-predatória de E. scolopes durante atividades noturnas 8,9, enquantoo tecido hospedeiro rico em nutrientes fornece V. fischeri com um nicho protegido 10. Durante cada geração de acolhimento, esta relação é recapitulada, representando assim um processo previsível que pode ser avaliado em detalhe em vários estágios de desenvolvimento simbiótico. No laboratório, a juvenil lula escotilha aposymbiotically (não colonizada), e, se recolhida dentro dos primeiros 30-60 minutos e transferida para simbionte livre de água, não podem ser colonizados excepto por o inoculo experimental 6. Esta interacção proporciona assim um sistema modelo útil no qual se pode avaliar os passos individuais que levam à aquisição específica de um micróbio simbiótica a partir do ambiente 11,12.

Aqui nós descrevemos um método para avaliar o grau de colonização que ocorre quando recém-eclodidos E. aposymbiotic scolopes são expostos a (artificial) a água do mar que contêm V. fischeri. Este ensaio simples descreve a inoculação, a infecção natural, e recuperaçãodo simbionte bacteriano do órgão luz nascente da E. scolopes Care. é levado para proporcionar um ambiente consistente para os animais durante o desenvolvimento simbiótico, especialmente no que diz respeito à qualidade da água e sinais de luz. Métodos para caracterizar a população simbiótico descrito incluem (1) medição da bioluminescência bactérias derivados, e (2) colônia contagem direta de simbiontes recuperados.

Protocol

1. Preparação de inóculos Dia 0 Dois dias antes da inoculação lula, o prato de cepas bacterianas relevantes sobre LBS 13 ágar. Incubar as bactérias em 25-28 ° C durante a noite. Dia 1 Inocular 3 ml de meio LBS em um tubo de vidro com uma cultura de cada colônia V. fischeri linhagem de infecção. Prepare duplicar tubos como backup. Dia 2 (Coordenar passos bacterianas 1,4-1…

Discussion

O ensaio de colonização descrito permite a análise de um processo natural simbiótica num ambiente controlado de laboratório. Como tal, pode ser usado para avaliar a colonização por estirpes mutantes, por diferentes isolados naturais, e sob regimes químicas diferentes. Variações sobre os experimentos descritos são comumente usados ​​para avaliar diferentes aspectos da simbiose. A cinética da colonização pode ser medido por análise de luminescência durante as primeiras 24 h, o que pode ser detectado au…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem Mattias Gyllborg para squid apoio instalações e dos comentários deste manuscrito, Michael Hadfield eo Kewalo Laboratório Marinho de assistência durante a coleta de campo, e os membros do Laboratório de Ruby e McFall-Ngai para contribuições para este protocolo. Trabalho no Laboratório de Mandel é suportado pela NSF IOS-0843633.

Materials

Name of reagent Company Catalogue Number Comments
Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter VWR 47729-580  
Caps for Glass Culture Tubes Fisher NC9807998  
Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 Biowave CO8000 Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used.
GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer Promega E5311 Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder.
GloMax 20/20 Light Standard Promega E5341 For luminometer calibration.
Refractometer, Handheld Foster and Smith Aquatics CD-14035 Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up.
Instant Ocean (artificial seawater concentrate) Foster & Smith Aquatics CD-16881 Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter.
Filtration Unit Nalgene 158-0020 Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters.
Transfer Pipettes Fisher 13-711-9AM Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings.
Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) Comet T9S (9 oz.) Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9.
Drosophila Vials VWR 89092-720 Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT.
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ISC Bioexpress C-3217-1CS Tubes must fit the shape of the pestles.
Ethanol, 200 Proof Fisher BP2818-100  
Pestles Kimble Chase/Kontes 749521-1500  
Plating Beads, 5 mm diameter Kimble Chase 13500 5 Prepare 5 per tube and autoclave.

Referências

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
  3. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
  4. Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
  5. Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
  6. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
  7. Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
  8. McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
  9. Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
  10. Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
  11. Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
  12. Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  13. Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
  14. Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
  15. Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
  16. Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).

Play Video

Citar este artigo
Naughton, L. M., Mandel, M. J. Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri. J. Vis. Exp. (61), e3758, doi:10.3791/3758 (2012).

View Video