Une technique simplifiée pour<em> In situ</emExcision> de la cornée et éviscération du tissu rétinien de globe oculaire humain

Summary

Le document décrit une technique simplifiée pour la cornée d'accise et d'éviscérer les tissus rétiniens du globe oculaire de l'homme donneurs cadavériques. La technique décrite ici aidera à accises tissus de bonne qualité pour être utilisés aux fins de transplantation, la chirurgie ou de recherche sans endommager les autres tissus du globe oculaire.

Abstract

Énucléation est le processus de récupération du globe oculaire à partir d'un donneur décédé en laissant le reste du globe non perturbé. Excision se réfère à la récupération des tissus oculaires, en particulier la cornée, en le coupant distinct du globe oculaire. L'éviscération est le processus d'élimination des organes internes visés ici que la rétine. Le globe oculaire est constitué de la cornée, la sclère, le corps vitré, la lentille, l'iris, la rétine, la choroïde, etc muscles (figure Suppl. 1). Quand un patient souffre de lésions de la cornée, la cornée doit être retiré et une saine doit être transplanté par des cabinets de kératoplastique. Troubles génétiques ou des malformations dans la fonction rétinienne peut compromettre la vision. Globes oculaires de l'homme peut être utilisé pour diverses procédures chirurgicales telles que la banque des yeux, la transplantation de la cornée humaine ou de la sclérotique et de la recherche sur les tissus oculaires. Cependant, il ya peu d'informations disponibles sur l'excision de la cornée et la rétine humaine, probablement due à la ll'accessibilité imited aux tissus humains. La plupart des études décrivant les procédures similaires sont effectuées sur des modèles animaux. Les chercheurs comptent sur la disponibilité des tissus oculaires bien disséquées et très bien conservée afin d'étendre les connaissances sur le développement œil humain, l'homéostasie et de la fonction. Comme nous recevons grande quantité de globes oculaires dont environ 40% (tableau 1) d'entre eux sont utilisés à des fins de recherche, nous sommes en mesure d'effectuer énorme quantité d'expériences sur ces tissus, la définition des techniques à l'accise et de les préserver régulièrement.

La cornée est un tissu avasculaire qui permet la transmission de la lumière sur la rétine et à cette fin devrait toujours maintenir un bon degré de transparence. Dans la cornée, la région du limbe, qui est un réservoir de cellules souches, aide à la reconstruction des cellules épithéliales et limite la prolifération de la conjonctive maintien de la transparence de la cornée et la clarté. La taille et la e ickness de la cornée sont essentiels pour une vision claire, des changements dans l'un d'eux pourrait conduire à distraire, vision floue. La cornée est composée de 5 couches; a) l'épithélium, b) la couche de Bowman, c) stroma, d) la membrane de Descemet et e) l'endothélium. Toutes les couches doivent fonctionner correctement pour assurer une vision claire ^4,5,6. La choroïde est la tunique intermédiaire entre la sclérotique et la rétine, délimitée à l'intérieur par la membrane de Bruch et est responsable de la circulation sanguine dans l'œil. La choroïde contribue également à réguler la température la nourriture et des fournitures pour les couches externes de la rétine ^5,6. La rétine est une couche de tissu nerveux qui couvre le dos du globe oculaire (Figure Suppl. 1) et se compose de deux parties: une partie photoréceptrice et une partie non-réceptifs. La rétine permet de recevoir la lumière de la cornée et le cristallin et le convertit en énergie chimique éventuellement transmis au cerveau avec l'aide du nerf optique ^5,6.

ove_content "> Le but de ce document est de fournir un protocole pour la dissection des tissus de la cornée et la rétine de globes oculaires de l'homme. Éviter la contamination croisée avec des tissus adjacents et en préservant l'intégrité ARN est d'une importance fondamentale que ces tissus sont indispensables à des fins de recherche visant à (i) la caractérisation du transcriptome des tissus oculaires, (ii) l'isolement de cellules souches pour des projets de médecine régénérative, et (iii) l'évaluation des différences histologiques entre les tissus normaux de / touchée sujets. Dans cet article, nous décrivons la technique que nous utilisons actuellement pour éliminer la cornée, la choroïde et la rétine des tissus à partir d'un globe oculaire. Ici nous fournissons un protocole détaillé pour la dissection du globe oculaire humaine et l'excision des tissus de la cornée et la rétine. La vidéo d'accompagnement aidera les chercheurs à en apprendre une technique appropriée pour la récupération de précieux tissus humains, qui sont difficiles à trouver régulièrement.

Protocol

1. Dans excision in situ de la cornée à partir de globes oculaires Allumez la hotte à flux laminaire de l'air environ 15 minutes avant utilisation. Nettoyer la hotte à flux laminaire en utilisant 70% d'alcool isopropylique. Mettre des vêtements de protection individuelle tels que bonnet de chirurgien et le masque. Frotter les mains et les avant-bras et sécher avec une serviette stérile. Porter des gants stériles et une blouse ou des manchons en utilisant une technique aseptiq…

Discussion

Les deux, l'excision correcte et la bonne conservation des tissus de la cornée et la rétine sont essentielles comme des défauts mineurs tels que des lésions endothéliales ou nombre élevé de plis de Descemet peut conduire à l'échec de greffe de la cornée tandis que les modifications de température ou une mauvaise manipulation peut compromettre l'intégrité des tissus rétiniens. Le but de cet article est de montrer comment les tissus de la cornée et la rétine peut être isolé de manière optima…

Materials

Materials for excision of cornea and retina.

Product description	Dimensions	Company / Institute
Guarded disposable scalpel	Blade size 15	Swann-Morton
Sterile bandages	5 cm X 5 cm, 8 layered, 5 pcs	Artsana
Sterile disposable medical towel	35 X 50 cm	U.Jet
Sterile scissors	Blades 24 mm / overall length. 95 mm curved, blunt	e.janach
Sterile forceps	Stainless steel -100 mm 11 X 2 ruled by 0.70 mm teeth	e.janach
Corneal claw – Disposable medical device		NIIOS (Hippocratech)
	Preparations
PBS	100 ml PBS [10x] in 900 ml d/w (distilled water)	Sigma-Aldrich
Na-thiosulphate	1 gm Na-thiosulphate in 1 litre of PBS [1x]	Sigma-Aldrich
I-PVP	5 gm I-PVP in 1 litre d/w	Sigma-Aldrich

Table 2. The table describes the materials used for excision of cornea and retina and the company they are received from.

Materials for storage medium (2000 ml).

Components	Supplier	Catalogue number	Concentration	Quantity
MEM (1X) liquid	Invitrogen	32360-034		1900 ml
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-039	1mM (10ml/l)	20 ml
L-glutamine	Invitrogen	25030-032	2mM (10ml/l)	20 ml
Antibiotic/antimycotic	Sigma-aldrich	A5955-20ML	10ml/l	20 ml
Newborn calf serum	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml/l)	40 ml

Table 3. Materials for storage medium.

Preparation of storage medium

Add all the ingredients using the specific concentrations as given above in a jar and mix well. Filter them using pore size of 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) with help of a peristaltic pump. Preserve the medium in the bottles at RT.

Materials for transport medium (2000 ml).

Components	Supplier	Catalogue number	Concentration	Quantity
MEM (1X) liquid	Invitrogen	32360-034		1800 ml
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-039	1mM (10 ml/l)	20ml
L-glutamine	Invitrogen	25030-032	2mM (10 ml/l)	20ml
Newborn calf serum	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml/l)	40 ml
Dextran t500	Pharmacosmos	551005004007	6% (60 gm/litre)	120 g/l

Table 4. Material for transport medium.

Preparation of transport medium

Add Dextran 6% in ~ 1.5 litre of MEM and leave it overnight. Add the rest of ingredients in the media and filter using 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) using a vacuum pump. Preserve the medium in the bottles at RT.