GC-gebaseerde detectie van Aldononitrile Acetaat Gederivatiseerde Glucosamine en Muramic Zuur voor Microbiële Residu Bepaling in de bodem
Summary
We beschrijven een methode protocol voor de GC-gebaseerde analyse van de aldonitrile acetaat derivaten van glucosamine en muramic zuur gewonnen uit de bodem. Ter verduidelijking van de chemische mechanisme ook een strategie op de structuur van het derivaat en de ion gevormde fragmenten op elektronen ionisatie bevestigen.
Abstract
Kwantitatieve benaderingen van het karakteriseren van micro-organismen zijn cruciaal voor een breder begrip van de microbiële status en functie binnen ecosystemen. De huidige strategieën voor microbiële analyse zowel traditionele laboratorium cultuur-afhankelijke technieken en op basis van directe extractie en de vaststelling van bepaalde biomarkers 1, 2. Er zijn maar weinig onder de diversiteit van microbiële soorten bewonen bodem kan worden gekweekt, zodat cultuur-afhankelijke methoden in te voeren belangrijke vooroordelen, een beperking afwezig in biomarker analyse.
De glucosamine, mannosamine, galactosamine en muramic zuur zijn goed gediend als maatregelen van zowel de levenden en de doden microbiële massa, van die de glucosamine (meest voorkomende) en muramic zuur (uniek van bacteriële cel) zijn de belangrijkste bestanddelen in de bodem systemen 3 4. Echter, het gebrek aan kennis over de analyse beperkt de brede popularisering onder de wetenschappelijke collega's. Van alle Existeken analysemethoden, derivatisering tot aldononitrile acetaten gevolgd door GC-gebaseerde analyse is naar voren gekomen als een goede optie met betrekking tot een optimale afweging van precisie, gevoeligheid, eenvoud, goede chromatografische scheiding, en de stabiliteit bij de opslag van monsters 5.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een betrouwbare en relatief eenvoudige analyse van glucosamine en muramic zuur uit bodem na hun bekering tot aldononitrile acetaten. Het protocol omvat hoofdzakelijk vier stappen: zuur spijsvertering, monster zuivering, derivatisering en GC vastberadenheid. De stap-voor-stap procedure wordt aangepast aan voormalige publicaties 6, 7. Daarnaast presenteren we een strategie om structureel valideren van de moleculaire ionen van het derivaat en de ion-fragmenten gevormd op elektron ionisatie. Wij pasten GC-MS-EI-SIM, LC-ESI-TOF-MS en isotopisch gelabeld reagens het molecuulgewicht van aldononitrile acetaat gederivatiseerde glucosamine en mur bepalenAmic zuur, gebruikten we de massa verschuiving van isotopen gemerkt zijn derivaten in de ion-spectrum om ion fragmenten van elk 8 derivaten te onderzoeken. Naast de theoretische verklaring, de validatie van moleculaire ionen van het derivaat en de ion fragmenten nuttig onderzoekers die δ 13 C of ion fragmenten van deze biomarkers in biogeochemische studies 9, 10.
Protocol
Discussion
De gepresenteerde GC-gebaseerde methode voor de analyse van aldononitrile acetaat gederivatiseerde glucosamine en muramic zuur zorgt voor een relatief snelle methode om deze aminozuren suikers, gewonnen uit de bodem te kwantificeren. De derivaten zijn chemisch stabiel en kan worden bepaald in een analyse. De werkwijze is niet beperkt tot bodemmonsters, en kan worden vereenvoudigd monsters van niet-bodem matrix.
De vacuümpomp in deze methode is gebouwd om zuurbestendig. We suggereren verder …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494). We zijn dankbaar aan Dr Xudong Zhang en zijn groepsleden voor nuttige technische discussies en waardevolle commentaar op het finaliseren van het protocol.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 |
| Methanol (dry) | Acros organics | AC326950010 |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros organics | AC148270050 |
| Ethyl acetate | VWR International | BJGC100-4 |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros organics | AC174670050 |
| D-glucose-U-13C | Cambridge isotope lab | CLM-1396-1 |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge isotope lab | NLM-713-1 |
| Name of the equipment | Company | Tipo |
| Rapid-Vap | LabConco | 790002 |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
Referências
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W., Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. . Assessment Methods for Soil Carbon. , 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars – a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
