GC-based Detection di acetato derivatizzata Glucosamina e muramico Acid Aldononitrile per la determinazione dei residui microbica nel terreno
Summary
Noi descriviamo un protocollo di metodo per la GC-analisi, basata su strumenti derivati di acetato di aldonitrile di glucosamina e acido muramico estratti dal suolo. Per chiarire il meccanismo chimico, si presentano anche una strategia per confermare la struttura del derivato ed i frammenti di ioni formate sulla ionizzazione elettronica.
Abstract
Quantitavo dei microrganismi che caratterizzano sono essenziali per una comprensione più ampia dello stato microbica e la funzione all'interno degli ecosistemi. Attuali strategie per l'analisi microbiologica di laboratorio tradizionali comprendono sia la cultura-dipendenti tecniche e quelle basate su estrazione diretta e la determinazione di alcuni biomarcatori 1, 2. Pochi tra la diversità delle specie microbiche abitano suolo possono essere coltivate, in modo da cultura-dipendenti metodi introdurre distorsioni significative, una limitazione assente nelle analisi di biomarker.
L'acido glucosamina, mannosammina, galattosamina e muramico sono stati ben servito come misure sia i vivi ei morti di massa microbica, di questi l'acido della glucosamina (più abbondante) e muramico (unicamente dalla cellula batterica) sono costituenti più importanti nei sistemi suolo 3 , 4. Tuttavia, la mancanza di conoscenza sulle analisi limita la divulgazione a livello scientifico tra pari. Tra tutti existing metodi analitici, derivatizzazione di aldononitrile acetati seguita da GC-based analisi è emerso come una buona opzione rispetto a bilanciare in modo ottimale precisione, sensibilità, semplicità, buona separazione cromatografica, e la stabilità durante lo stoccaggio del campione 5.
Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per un'analisi affidabile e relativamente semplice di glucosamina e acido muramico dal terreno dopo la loro conversione al acetati aldononitrile. Il protocollo comprende principalmente quattro fasi: digestione acida, purificazione del campione, derivatizzazione e determinazione GC. Il passo-passo procedura viene modificato secondo ex pubblicazioni 6, 7. Inoltre, presentiamo una strategia per convalidare strutturalmente lo ione molecolare del derivato e suoi frammenti ionici formato sulla ionizzazione elettronica. Abbiamo applicato GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS e reagenti marcati con isotopi per determinare il peso molecolare di acetato glucosamina aldononitrile derivatizzata e murL'acido Amic, abbiamo usato lo spostamento di massa di isotopi marcati derivati nello spettro di ioni di indagare frammenti di ioni di ogni derivati 8. Oltre alla spiegazione teorica, la convalida di ione molecolare del derivato e suoi frammenti ionici sarà utile per ricercatori utilizzando δ 13 C o frammenti ionici di questi marcatori in studi biogeochimici 9, 10.
Protocol
Discussion
Il presentato GC-based metodo per l'analisi di acetato derivatizzata glucosammina e acido muramico aldononitrile fornisce un metodo relativamente rapido per quantificare questi amminoacidi, zuccheri estratti dal suolo. I derivati sono chimicamente stabili, e può essere determinata in analisi. Il metodo non è limitato a campioni di terreno, e può essere semplificata per campioni di suolo non-matrice.
La pompa a vuoto utilizzata in questo metodo è costruito per essere resistenti …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti DOE Bioenergy Great Lakes Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494). Siamo grati al Dr. Zhang Xudong membri del gruppo e dei suoi utili per le discussioni tecniche e commenti preziosi sulla messa a punto del protocollo.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 |
| Methanol (dry) | Acros organics | AC326950010 |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros organics | AC148270050 |
| Ethyl acetate | VWR International | BJGC100-4 |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros organics | AC174670050 |
| D-glucose-U-13C | Cambridge isotope lab | CLM-1396-1 |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge isotope lab | NLM-713-1 |
| Name of the equipment | Company | Tipo |
| Rapid-Vap | LabConco | 790002 |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
Referências
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