Simples dispositivos microfluídicos para<em> In vivo</em> Imaging de<em> C. elegans</em>,<em> Drosophila</em> E Zebrafish
Summary
Um dispositivo simples de microfluidos foi desenvolvido para realizar anestésico livre<em> In vivo</em> Imagiologia de<em> C. elegans</em>, Intacta<em> Drosophila</em> Larvas e larvas de peixe-zebra. O dispositivo utiliza uma membrana deformável PDMS para imobilizar estes organismos modelo, a fim de realizar imagem de lapso de tempo de vários processos, tais como o batimento cardíaco, a divisão celular e subcelular transporte neuronal. Nós demonstramos a utilização deste dispositivo e mostram exemplos de diferentes tipos de dados recolhidos a partir de sistemas de modelos diferentes.
Abstract
Micro fabricados dispositivos fluídicos fornecer um micro-ambiente acessíveis para estudos in vivo sobre os organismos pequenos. Processos de fabricação simples estão disponíveis para dispositivos microfluídicos usando técnicas de litografia suave 1-3. Dispositivos microfluídicos têm sido utilizados para sub-celular de imagem 4,5, in vivo microcirurgia laser 2,6 e imagiologia celular 4,7. In vivo de imagem requer a imobilização dos organismos. Isto foi conseguido usando sucção 5,8, 6,7,9 canais cónicos, membranas deformáveis 2-4,10, com arrefecimento adicional de sucção 5, o gás anestésico 11, geles sensíveis à temperatura 12, 13 e cola de cianoacrilato, tais como anestésicos levamisole 14 de 15. Anestésicos comumente utilizados influenciar a transmissão sináptica 16,17 e são conhecidos por terem efeitos prejudiciais sobre a sub-celular de transporte 4 neuronal. Neste stUdy demonstramos uma membrana de base de poli-dimetil-siloxano dispositivo (PDMS) que permite a imobilização sem anestésico intactos organismos modelo genéticas tais como Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila e larvas de larvas de peixe zebra. Estes organismos modelo são adequados para estudos in vivo em dispositivos microfluídicos devido às suas diâmetros pequenos e corpos opticamente transparentes ou translúcidas. Diâmetros de corpo variar de 10 a ~ uM ~ 800 uM para os primeiros estádios larvais de C. elegans e larvas do peixe-zebra e exigir dispositivos microfluídicos de tamanhos diferentes para atingir a imobilização completa de alta resolução de imagem time-lapse. Estes organismos são imobilizadas através de pressão aplicada por comprimido de gás de azoto através de uma coluna de líquido e visualizados utilizando um microscópio invertido. Animais libertados da armadilha retornar para locomoção normais dentro de 10 min.
Demonstramos quatro aplicações de lapso de tempo de imagem em C. elegansou seja, a imagem de transporte mitocondrial nos neurônios, pré-sináptica transporte vesicular em um transporte defeituoso mutante transporte receptor, glutamato e divisão celular Q neuroblastos. Os dados obtidos a partir de tais filmes mostram que a imobilização de microfluidos é um meio útil e precisa de adquirir dados de vivo de eventos celulares e subcelulares em comparação com animais anestesiados (Figura 1J e 3C F-4).
Dimensões do dispositivo foram alteradas para permitir lapso de tempo imagens de diferentes fases da C. elegans, primeiro larvas Drosophila e larvas de peixe-zebra. Transporte de vesículas marcadas com sinaptotagmina marcados com GFP (syt.eGFP) em neurônios sensoriais mostra movimento dirigido de marcadores das vesículas sinápticas expressos em colinérgicos neurônios sensoriais intactas em primeira larvas Drosophila estádio. Um dispositivo semelhante tem sido utilizada para a realização de lapso de tempo de imagem de pulsação em ~ 30 h pós-fertilização (hpf)Zebrafish larvas. Estes dados mostram que os dispositivos simples que desenvolvemos pode ser aplicada a uma variedade de sistemas modelo para estudar os fenómenos biológicos diversos celulares e de desenvolvimento in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dispositivos PDMS microfluidicos são opticamente transparentes, por conseguinte, pode ser utilizado em alta resolução em imagiologia in vivo de qualquer organismo modelo transparente / translúcida. Nosso projeto é adequado para alta de ampliação de imagem espaço-temporal de eventos celulares e sub-celular em intactas animais vivos. Microfabricação utilizando técnicas de litografia suave permite uma fácil manipulação de dimensões do dispositivo para vários tamanhos de organismos modelo. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Krishanu Ray para ações de Drosophila, Tarjani Agarwal para a manutenção de uma gaiola Drosophila, Peter Juo para nuIs25 e CGC para C. estirpes elegans. SPK jsIs609 feito em laboratório de Michael Nonet. Agradecemos Arpan Agnihotri (BITS Pilani) por sua ajuda na lapso de tempo de imagem do transporte de mitocôndrias jsIs609 animais em dispositivos microfluídicos. Somos gratos ao Dr. Vatsala Thirumalai e Prakash Surya para fornecer-nos com embriões de zebrafish. Agradecemos ao Dr. Krishna e CIFF em BCN para uso do microscópio confocal disco giratório apoiado pelo Departamento de Ciência e Tecnologia Centro-de Nanotecnologia (No. SR/55/NM-36-2005). Agradecemos também Kaustubh Rau, V. Venkatraman e Chetana Sachidanand para as discussões. Este trabalho foi financiado pela bolsa de pós-doutorado DBT (SM), o esquema de DST fast-track (SM) e uma subvenção de DBT (SPK). SA foi apoiado pelo horário de verão e CSIR subsídios a SPK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
Referências
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
- Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genética. 95, 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
- Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
- Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
- Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
- Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
- Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
- Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
- Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
- Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
