Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için geliştirilmiştir<em> In vivo</emVe> görüntüleme<em> C. elegans</em>, Intakt<em> Drosophila</em> Larva ve zebrafish larva. Cihaz, kalp ritmi, hücre bölünmesi ve hücre altı nöronal ulaşım gibi birçok süreçlerin zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için bu model organizmalar hareketsiz bir deforme PDMS membran kullanır. Biz bu cihazın kullanımını göstermek ve farklı model sistemlerinden toplanan verilerin farklı örnekler göstereceğiz.
Mikro fabrikasyon akışkan cihazları küçük organizmalar üzerinde in vivo çalışmalar için erişilebilir bir mikro-ortam sağlar. Basit üretim işlemlerinde yumuşak litografi teknikleri kullanarak 1-3 mikroakışkan cihazlar için kullanılabilir. Mikroakışkan cihazlar vivo lazer mikrocerrahi 2,6 ve hücresel görüntüleme 4,7 alt hücresel görüntüleme 4,5, için kullanılmaktadır. Vivo görüntüleme organizmaların immobilizasyon gerektirir. Bu emiş 5,8 kullanılarak elde edilmiştir, konik kanalların 6,7,9, deforme membranlar 2-4,10, ek soğutma 5, anestezik gaz 11, ısıya duyarlı jeller 12, siyanoakrilat yapıştırıcı 13 ve böyle levamizol 14 gibi anestezikler ile emiş , 15. Yaygın olarak kullanılan anestezik sinaptik iletim 16,17 etkilemek ve alt hücresel nöronal ulaştırma 4 üzerinde zararlı etkileri olduğu bilinmektedir. Bu study biz böyle Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larva ve zebrafish larva gibi bozulmamış genetik model organizmaların anestezik ücretsiz immobilizasyon sağlar poli-dimetil-siloksan (PDMS) aygıtı dayalı bir membran göstermektedir. Bu model organizmalar nedeniyle küçük çaplı ve optik olarak saydam veya yarı saydam cisimlerin mikroakışkan cihazlar in vivo çalışmalar için uygundur. Gövde çapları C. erken larva aşamaları için ~ 10 mikron dan ~ 800 mikron arasında değişir elegans ve zebrafish larva ve yüksek çözünürlüklü time-lapse görüntüleme için tam immobilizasyon elde etmek için farklı boyutlarda mikroakışkan cihazlar gerektirir. Bu organizmalar, bir sıvı sütunu ile sıkıştırılmış azot gazı tarafından uygulanan ve bir inverted mikroskop kullanarak görüntülü basıncı kullanılarak immobilize edilmiştir. Tuzak salınan Hayvanlar 10 dakika içinde normal hareket döner.
Biz C. time-lapse görüntüleme dört uygulamaları göstermek elegansyani nöronların görüntüleme mitokondriyal ulaşım, nakliye kusurlu mutant, glutamat reseptör ulaşım ve Q neuroblast hücre bölünmesinde presinaptik vezikül taşınması. Bu tür filmler elde edilen veriler mikroakış immobilizasyon anestezi uygulanmış hayvanlar (Şekil 3C ve 1J 4-F) göre, hücresel ve alt-hücresel olayların in vivo veriler elde yararlı bir araçtır ve kesin olduğunu göstermektedir.
Cihaz boyutları C. farklı aşamalarında time-lapse görüntüleme sağlamak için değiştirilmiş elegans, ilk evre Drosophila larva ve zebrafish larva. Duyusal nöronlarda GFP (syt.eGFP) ile etiketlendi synaptotagmin ile işaretlenmiş veziküllerin Ulaştırma bozulmadan ilk evre Drosophila larvaları kolinerjik duyusal nöronlarda eksprese sinaptik vezikül belirteçlerin yönlü hareketi gösterir. Benzer bir cihaz ~ 30 saat sonrası fertilizasyon (HPF) içinde kalp atışı time-lapse görüntüleme yürütmek için kullanılır olmuşturlarva zebrafish. Bu veriler, geliştirdiğimiz basit cihazlar vivo çeşitli hücre biyolojik ve gelişimsel fenomenleri araştırma modeli sistemleri çeşitli uygulanabilir olduğunu göstermektedir.
PDMS microfluidic cihazlar bu nedenle herhangi bir yarı saydam / şeffaf model organizma ve in vivo görüntüleme yüksek çözünürlük için kullanılan optik olarak transparan vardır. Bizim tasarım bozulmadan canlı hayvan hücresel ve alt hücresel olayların yüksek büyütme uzay-zamansal görüntüleme için uygundur. Yumuşak litografi teknikleri kullanarak Mikro ve model organizmaların çeşitli boyutlar için cihaz boyutları kolay manipülasyon sağlar. Çeşitli büyüklüklerde aygıtlar …
The authors have nothing to disclose.
Biz C. için nuIs25 ve CGC için, bir Drosophila kafes korumak için Drosophila stok, Tarjani Agarwal Peter Juo Dr Krishanu Ray ederim elegans suşları. SPK Michael Nonet laboratuvarında jsIs609 yaptı. Biz mikroakışkan cihazlar jsIs609 hayvanların mitokondri ulaşım time-lapse görüntüleme onun yardım Arpan Agnihotri (BITS Pilani) teşekkür ederim. Biz zebrafish embriyolar bize sağlamak için Dr Vatsala Thirumalai ve Surya Prakash minnettarız. Biz Nanoteknoloji (No SR/55/NM-36-2005) Bilim ve Teknoloji-Merkezi Başkanlığı tarafından desteklenen dönen diske konfokal mikroskop kullanımı için NCB'ları Dr Krishna ve CIFF ederim. Biz de tartışmalar için Kaustubh Rau, V. Venkatraman ve Chetana Sachidanand ederim. Bu çalışma DBT doktora bursu (SM), DST fast-track düzeni (SM) ve bir DBT hibe (SPK) tarafından finanse edildi. SA SPK DST ve CSIR bağışları ile desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
Developer | Microchem | SU8 Developer | |
Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |