Identifisering av protein komplekser i<em> Escherichia coli</em> Med sekvensiell Peptide affinitetsrensing i kombinasjon med tandem massespektrometri

Summary

Affinitetsrensing av kodede proteiner i kombinasjon med massespektrometri (APMS) er en kraftig metode for systematisk kartlegging av protein interaksjon nettverk og for å undersøke den mekanistiske grunnlag av biologiske prosesser. Her beskriver vi en optimalisert sekvensiell peptid affinitet (SPA) APMS prosedyre utviklet for bakterien<em> Escherichia coli</em> Som kan brukes til å isolere og karakterisere stabile multi-protein komplekser til nær homogenitet selv starter fra lave kopiere numre per celle.

Abstract

Siden de fleste cellulære prosesser er mediert av makromolekylære forsamlinger, systematisk identifisering av protein-protein interaksjoner (PPI) og identifikasjon av subenheten sammensetningen av multi-protein komplekser kan gi innsikt i genfunksjon og forbedre forståelsen av biologiske systemer ^{1, 2.} Fysiske interaksjoner kan kartlegges med høy tillit vialarge-skala isolering og karakterisering av endogene protein komplekser under nær-fysiologiske forhold basert på affinitetsrensing av kromosomer-merket proteiner i kombinasjon med massespektrometri (APMS). Denne tilnærmingen har blitt brukt i evolusjonært ulike organismer, inkludert gjær, flue, mark, pattedyrceller, og bakterier ^1-6. Spesielt har vi generert en karboksy-terminal Sekvensiell Peptide Affinity (SPA) dual merkesystem for affinitets-rensing innfødte protein komplekser fra dyrkede gram-negative Escherichia coli ved hjelp GEnetically-medgjørlig vert laboratoriestammer som er godt egnet for genom-wide undersøkelser av grunnleggende biologi og bevart prosesser ^{en prokaryoter, 2, 7.} Vår SPA-merkesystem er analog til den tandem affinitetsrensing metode utviklet opprinnelig for gjær ^{8, 9,} og består av en kalmodulin bindende peptid (CBP) etterfulgt av kuttesete for svært spesifikk tobakk etch virus (TEV) protease og tre kopier av flagget epitop (3X FLAG), slik at for to påfølgende runder med affinitet berikelse. Etter kassett forsterkning, er sekvens-spesifikke lineære PCR produkter koder for SPA-kode og en selekterbar markør integrert og uttrykt i ramme som karboksy-terminale fusjoner i en DY330 bakgrunn som er indusert til forbigående uttrykke en svært effektiv heterologt bakteriofag lambda rekombinasjon systemet ^10. Påfølgende dual-trinns rensing ved hjelp calmodulin og Anti-Flag affinitet perler gjør at svært selektivog effektiv utvinning av selv lave overflod protein komplekser fra store kulturer. Tandem massespektrometri blir så brukt til å identifisere stabilt co-rensende proteiner med høy følsomhet (lav nanogram deteksjonsgrenser).

Her beskriver vi detaljerte steg-for-trinn prosedyrer vi vanligvis bruker for systematisk protein tagging, rensing og massespektrometri-baserte analyser av løselig protein komplekser fra E. coli, som kan skaleres opp og potensielt tilpasset andre bakterielle arter, inkludert visse opportunistiske patogener som kan påvirkes med recombineering. De resulterende fysiske interaksjoner kan ofte avsløre interessante uventede komponenter og forbindelser som tyder nye mekanistiske lenker. Integrering av PPI data med alternative molekylære foreningen data som genetiske (gen-gen) interaksjoner og genomisk sammenhengen (GC) spådommer kan lette klarlegging av den globale molekylære organisering av multi-protein komplekser innen biological veier. Nettverkene som genereres for E. coli kan brukes til å få innsikt i den funksjonelle arkitekturen orthologous genprodukter i andre mikrober som funksjonelle merknader er for tiden mangler.

Protocol

1. Bygging av Gene-spesifikk SPA-merking i E. coli DY330 Strain Plasmidet pJL148 omfatter SPA-tag DNA-sekvensen og den kanamycin antibiotikaresistens markør kassett (Kan R) brukes som en mal i polymerase kjedereaksjon (PCR) amplifikasjon 7. En 45 nt gen-spesifikk forward primer, som ligger umiddelbart oppstrøms av målgenet stoppkodonet i ramme med en 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tag spesifikk forward primer, og en 45 nt gen-spesifikk revers primer, ligg…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

En sentral del av SPA-baserte APMS tilnærming beskrevet her er at merking er utført innenfor den naturlige kromosomal sammenheng, og dermed sikre normal genregulering opprettholdes (ie. Innfødt agn promoter bevart, derav uttrykket nivåene ikke er opprørt) og innfødte stabilt-assosiert protein komplekser blir gjenvunnet på nær endogene nivåer. Operon polaritet problemer er også unngås ved å inkludere en utovervendte promoter i valgbar markør. SPA-merking tilnærmingen er effektivt nok til å rense k…

Materials

Materials	Vendor	and Catalog Numbers
			I. Antibiotics
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
			2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Yeast extract	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
			3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
			4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase	Fermentas	# EP0281
10 X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading dye	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Boric acid	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
			5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
			6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler	BioRad	iCycler
Agarose gel electrophoresis	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 °C water bath shaker		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 °C Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator	Fisher Scientific
			7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide	Bio-Rad	#161-0125
Ammonium persulfate	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 filter paper	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
Nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody	Sigma	#F3165
Horseradish peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards	Bio-Rad	#161-0363
Chemiluminescence reagent	PIERCE	#1856136
Autoradiography film	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw blotting paper	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
			8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Protease inhibitors	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
			9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
			10. Silver Staining Reagents
Methanol	Bioshop	#MET302
Acetic acid	Bioshop	t#ACE222
Sodium-thiosulfate	Sigma	#S-7143
Silver nitrate	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehyde	Bioshop	#FOR201
Sodium carbonate	Bioshop	#SOC512
			11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrile	Sigma	#A998-4
Formic acid	Sigma	#F0507
HPLC grade water	Sigma	#95304
Iodoacetamide	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin	Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer		Thermo Fisher Scientific
			12. Labware
4 liter conical flasks	VWR	#89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes	Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Any Vendor
250 ml conical flaks	VWR	#29140-045
15 ml sterile culture tubes	Thermo Scientific	#366052
Cryogenic vials	VWR	#479-3221
-80 °C freezer	Fisher Scientific	#13-990-14
Speed vacuum system	Thermo Scientific
			Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g Yeast Extract 2% Glycerol 50 ml potassium salt stock solution 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% Glycerol Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 30 g sodium carbonate 1000 ml distilled water 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid