의 단백질 단지의 식별<em> 대장균</em> 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Summary

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를 설명<em> 대장균</em>도 셀 당 낮은 사본 번호부터 근처의 동질성에 안정적인 멀티 단백질 복합체를 분리하고 특성화하는 데 사용할 수있는.

Abstract

대부분의 세포 프로세스 macromolecular 어셈블리, 단백질 – 단백질 상호 작용의 체계적인 식별 (PPI)와 단지는 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공하고 생물 시스템 ^{1, 2의} 이해를 향상시킬 수 있습니다 다중 단백질의 subunit 구성의 식별에 의해 중재되기 때문입니다. 물리적 상호 작용 대량 분석법 (APMS)와 함께 chromosomally 태그 단백질의 친 화성 정화에 따라 거의 생리적 조건 하에서 내생 단백질 단지의 높은 신뢰 vialarge 규모의 절연 및 특성에 매핑 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식이 성공적으로 효모, 파리, 웜, 포유류의 세포 및 박테리아 ^1-6 등의 evolutionarily 다양한 생물에 적용되었습니다. 특히, 우리는 GE를 사용하여 양식 그람 음성 대장균에서 선호도 – 정화 기본 단백질 단지의 카르복시 – 터미널 순차적 펩타이드 선호도 (SPA) 듀얼 태그 시스템을 생성 한기본 생물학, prokaryotes ^{1, 2, 7} 보존 프로세스의 게놈 전체의 조사에 적합 아르 netically – 다루기 쉬운 호스트 실험실 변종. 우리 SPA 태그 시스템은 효모 ^{8, 9} 원래 개발 된 직렬 선호도 정화 방법 유사하며, calmodulin 바인딩 구체적인 담배 에칭 바이러스 (TEV) 단백 분해 효소의 절단 사이트에서 다음 펩타이드 (CBP) 및 사본 3 부를 구성되어 있습니다 연관성 농축의 연속 2 발을 허용 플래그 에피토프 (3 배 플래그)의. 카세트 증폭 후, SPA-태그와 선택 마커를 인코딩 순서 특정 선형 PCR 제품은 통합되어 transiently 고효율 heterologous 박테리오파지 람다 재결합 시스템 ^(10)을 표현하도록 유도하는 DY330 배경으로 카르복시 – 터미널 fusions와 같은 프레임으로 표현. calmodulin 및 안티 플래그 연관성 구슬을 사용하여 후속 듀얼 단계 정화는 높은 선택을 가능하게대규모 문화도 낮은 풍부한 단백질 단지의 효율적인 복구. 직렬 질량 분석법 그 다음 높은 감도 (낮은 nanogram 검출 한계)를 안정적으로 공동 정화 단백질을 식별하는 데 사용됩니다.

여기, 우리는 우리가 일반적으로 체계적인 단백질 태그, 정화 및 대량 E.에서 수용성 단백질 단지의 분석법 기반의 분석을 위해 사용하는 자세한 단계별 절차를 설명 까지 확장 될 가능성이 recombineering 의무가있는 특정 기회 병원균 등 다른 세균 종에 맞게 할 수 있습니다 대장균. 그 결과 물리적 상호 작용은 종종 재미있는 예상치 못한 구성 요소와 소설 기계론의 링크를 제안 연결을 공개 할 수 있습니다. 이러한 유전자 (유전자 유전자) 상호 작용과 예측은 이중에서 다중 단백질 단지의 글로벌 분자 조직의 해설을 촉진 할 수 게놈 – 컨텍스트 (GC)와 같은 다른 분자 협회 데이터와 PPI 데이터의 통합ological 경로. E.에 대해 생성 된 네트워크 대장균은 기능 주석이 현재 부족하는 다른 미생물의 orthologous 유전자 제품의 기능 구조에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. E.의 유전자 별 SPA 태그 추가 구축 대장균 DY330 변형 플라스미드 pJL148은 SPA-태그 DNA 시퀀스와 kanamycin 항생제 저항 아이콘 카세트 (관 R)를 포함한는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 7의 템플릿으로 사용됩니다. 27 BP (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') 태그 특정 앞으로 프라이머와 프레임에서 대상 유전자 정지 코돈 즉시 상류에 위치한 45 NT 유전자 특정 앞으로 …

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

여기에 설명 된 SPA 기반 APMS 방식의 핵심 부분은 태그가함으로써 정상적인 유전자 조절을 보장하는 것은 유지 (예. 기본 미끼업자의 앞 표현 수준이 어리둥절하지 않습니다, 보존) 및 안정적-관련 기본입니다, 자연 염색체 컨텍스트 내에서 수행되는 것입니다 단백질 단지는 거의 내생 수준에서 회수하고 있습니다. 오페론 극성 문제도 선택 마커의 외측 중심의 발기인을 포함하여 피할 수 있…

Materials

Materials	Vendor	and Catalog Numbers
			I. Antibiotics
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
			2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Yeast extract	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
			3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
			4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase	Fermentas	# EP0281
10 X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading dye	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Boric acid	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
			5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
			6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler	BioRad	iCycler
Agarose gel electrophoresis	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 °C water bath shaker		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 °C Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator	Fisher Scientific
			7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide	Bio-Rad	#161-0125
Ammonium persulfate	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 filter paper	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
Nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody	Sigma	#F3165
Horseradish peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards	Bio-Rad	#161-0363
Chemiluminescence reagent	PIERCE	#1856136
Autoradiography film	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw blotting paper	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
			8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Protease inhibitors	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
			9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
			10. Silver Staining Reagents
Methanol	Bioshop	#MET302
Acetic acid	Bioshop	t#ACE222
Sodium-thiosulfate	Sigma	#S-7143
Silver nitrate	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehyde	Bioshop	#FOR201
Sodium carbonate	Bioshop	#SOC512
			11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrile	Sigma	#A998-4
Formic acid	Sigma	#F0507
HPLC grade water	Sigma	#95304
Iodoacetamide	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin	Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer		Thermo Fisher Scientific
			12. Labware
4 liter conical flasks	VWR	#89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes	Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Any Vendor
250 ml conical flaks	VWR	#29140-045
15 ml sterile culture tubes	Thermo Scientific	#366052
Cryogenic vials	VWR	#479-3221
-80 °C freezer	Fisher Scientific	#13-990-14
Speed vacuum system	Thermo Scientific
			Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g Yeast Extract 2% Glycerol 50 ml potassium salt stock solution 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% Glycerol Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 30 g sodium carbonate 1000 ml distilled water 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid