Identificação de complexos de proteínas em<em> Escherichia coli</em> Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Summary

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a bactéria<em> Escherichia coli</em> Que pode ser usado para isolar e caracterizar estáveis ​​múltiplos complexos proteína-à homogeneidade a partir de perto mesmo números de cópias baixos por célula.

Abstract

Uma vez que a maioria dos processos celulares são mediadas por montagens macromoleculares, a identificação sistemática de interacções proteína-proteína (PPI) e à identificação da composição de subunidades de vários complexos de proteína pode fornecer informações sobre a função do gene e aumentar a compreensão dos sistemas biológicos ^{1 e 2.} Interacções físicas podem ser mapeados com alta confiança isolamento vialarge escala e caracterização de complexos de proteínas endógenas sob condições fisiológicas quase baseados em purificação de afinidade de proteínas cromossomicamente etiquetados em combinação com espectrometria de massa (STDA). Esta abordagem tem sido aplicada com sucesso em organismos evolutivamente diversas, incluindo levedura, moscas, vermes, células de mamíferos e bactérias ^1-6. Em particular, têm gerado um carboxi-terminal Affinity Peptide seqüencial (SPA) sistema de marcação dupla para afinidade com purificação de complexos de proteínas nativas cultivadas coli gram-negativas coli, usando genetically-tratáveis ​​hospedeiras estirpes laboratoriais que estão bem adaptados para as investigações do genoma da biologia fundamental e processos conservadas de procariotas ^{1, 2, 7.} O nosso sistema de SPA-marcação é análogo ao método de purificação por afinidade em tandem desenvolvido originalmente para levedura ^{8, 9,} e é composto por uma ligação peptídica a calmodulina (CBP), seguido do local de clivagem para a protease altamente específico do tabaco vírus etch (TEV) e três cópias do epitopo FLAG (FLAG 3X), permitindo dois ciclos consecutivos de enriquecimento por afinidade. Após a amplificação da cassete, a sequência específica de produtos lineares de PCR que codificam o SPA-tag e um marcador de selecção são integradas e expressas em quadro como carboxi-terminais fusões em um fundo DY330 que é induzida a expressar transitoriamente um altamente eficiente sistema de recombinação heteróloga bacteriófago lambda ^10. Purificação de dupla etapa subsequente utilizando calmodulina e grânulos anti-FLAG de afinidade permite a altamente selectivoe recuperação eficiente de até complexos de baixa abundância de proteínas de grande escala culturas. Espectrometria de massa é, então, usado para identificar as estavelmente co purificação de proteínas com uma sensibilidade elevada (limites de detecção baixos de nanogramas).

Aqui, descrevemos detalhadas passo-a-passo os procedimentos que comumente utilizam para purificação de proteínas sistemática de marcação, e espectrometria de massa com base em análise de complexos de proteínas solúveis de E. coli, que podem ser expandidos e potencialmente adaptada para outras espécies bacterianas, incluindo certos agentes patogénicos oportunistas que são passíveis de recombineering. As interações físicas resultantes muitas vezes pode revelar interessantes componentes inesperados e conexões sugerindo novas ligações mecanicistas. Integração dos dados do PPI com alternativas de associação de dados moleculares, como genéticos (gene-gene) interações e genômica de contexto (GC) previsões podem facilitar a elucidação da organização global molecular de proteínas multi-complexos dentro bicaminhos fisiológicos. As redes geradas por E. coli pode ser usado para obter insights sobre a arquitetura funcional de produtos de genes ortólogos em outros micróbios para que anotações funcionais actualmente não existem.

Protocol

1. Construção de Gene-específico SPA-marcação em E. Strain coli DY330 O plasmídeo pJL148 compreendendo a sequência de DNA SPA-tag e o cassete de canamicina marcador de resistência aos antibióticos (Kan R) são usadas como um modelo na reacção de polimerização em cadeia (PCR) 7. A 45 nt iniciador específico do gene para a frente, localizado imediatamente a montante do codão de paragem do gene alvo em enquadramento com um 27 ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAA…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

Um aspecto chave da abordagem baseada em STDA SPA descrito aqui, é que a marcação é feita dentro do contexto natural cromossómica, assegurando desse modo a regulação do gene normal é mantida (isto é. Isca promotor nativo conservado, portanto os níveis de expressão não é perturbada) e estavelmente nativo associado complexos de proteínas são recuperadas em quase endógenos níveis. Problemas de polaridade operão também são evitados mediante a inclusão de um promotor de orientada para o exterior…

Materials

Materials	Vendor	and Catalog Numbers
			I. Antibiotics
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
			2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Yeast extract	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
			3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
			4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase	Fermentas	# EP0281
10 X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading dye	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Boric acid	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
			5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
			6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler	BioRad	iCycler
Agarose gel electrophoresis	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 °C water bath shaker		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 °C Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator	Fisher Scientific
			7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide	Bio-Rad	#161-0125
Ammonium persulfate	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 filter paper	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
Nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody	Sigma	#F3165
Horseradish peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards	Bio-Rad	#161-0363
Chemiluminescence reagent	PIERCE	#1856136
Autoradiography film	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw blotting paper	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
			8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Protease inhibitors	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
			9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
			10. Silver Staining Reagents
Methanol	Bioshop	#MET302
Acetic acid	Bioshop	t#ACE222
Sodium-thiosulfate	Sigma	#S-7143
Silver nitrate	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehyde	Bioshop	#FOR201
Sodium carbonate	Bioshop	#SOC512
			11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrile	Sigma	#A998-4
Formic acid	Sigma	#F0507
HPLC grade water	Sigma	#95304
Iodoacetamide	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin	Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer		Thermo Fisher Scientific
			12. Labware
4 liter conical flasks	VWR	#89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes	Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Any Vendor
250 ml conical flaks	VWR	#29140-045
15 ml sterile culture tubes	Thermo Scientific	#366052
Cryogenic vials	VWR	#479-3221
-80 °C freezer	Fisher Scientific	#13-990-14
Speed vacuum system	Thermo Scientific
			Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g Yeast Extract 2% Glycerol 50 ml potassium salt stock solution 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% Glycerol Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 30 g sodium carbonate 1000 ml distilled water 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid