전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도
Summary
설계 근육 조직은 질병 모델로 또한 고기에 대한 대체 소스로, 재생 의료에 큰 가능성이 있습니다. 여기 마우스 myoblast의 전구 세포, 및 전기 펄스에 의해 자극에서이 경우에, 근육 구조의 기술에 대해 설명합니다.
Abstract
설계 근육 조직은 재생 의료 및 육류 대체 1로 압력 궤양을 공부하는 예를 체외에서 질병 모델로 사용하기위한 조직의 생산을 포함하는 여러 가지 목적으로 사용 할 수 있습니다. 첫 번째보고 3D 근육 구조는 몇 년 전에 만든 분야의 개척자 Vandenburgh 및 동료 2,3 아르되었습니다. 근육 조직 공학에서 만든 발전 생화학 요인, 줄기 세포 및 전구 세포에 대한 지식의 광대 한 이득의 결과뿐만 아니라하지만, 물리적 요인이 세포 행동 제어에 필수적인 역할을하는 연구자들에 의해 얻은 통찰력의 특정 기반에 있고 조직 개발. 첨단 엔지니어링 근육은 현재 셀 인구 히드로 겔 구조로 구성되어 구성합니다. 우리가 실험실에서이 일반적으로 C2C12, 미 손쥐 뒷다리 근육에서 분리 손쥐 myoblast의 전구 세포, 또는 손쥐 myoblast 세포 라인으로 구성콜라겐 / Matrigel의 혼합물로 xed 두 개의 고정 지점 사이의 도금, 근육 인대를 모방. 다른 세포는,뿐 아니라 L6 쥐 myoblasts 4, 신생아 근육 유래 전구 세포 5, 그러한 인간의 6도 유도 만능 줄기 세포 (IPS 세포) 7과 같은 다른 종에서 성인 근육 조직에서 파생 된 세포와 같은 예를 들어 다른 세포 라인을 고려 될 수있다 . 셀 수축성은 구조 8,9와 문화 약 1 주일 후에 근육 전구 세포의 분화의 긴 축을 따라 세포의 정렬을 발생합니다. 또한, 전기 자극의 응용 프로그램이 어느 정도 8로 차별화 과정을 향상시킬 수 있습니다. 때문에 그 제한된 크기 (8 X 2 X 0.5 mm)의 전체 조직은 예 생존, 분화 및 세포 정렬을 모니터링 할 공 촛점 현미경을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 특정 응용 프로그램에 enginee에 대한 요구 사항을 따라붉은 근육 조직은 경우에 따라 다릅니다, 다른 종에 고기 대체 번역이 필요한 역할을하는 동안 재생 의료에 대한 예를 들어 사용, 조직 크기와 vascularization의 최대 크기 조절이 필요합니다.
Protocol
1. 손쥐 Myoblast의 전구 세포 또는 C2C12 세포의 문화 처음 Shefer 및 동료 (10)에 의해 출판하고 나중에 콜린스 외. 11 Boonen 외. 12 적응 프로토콜에 따라 세포를 분리 및 액체 질소에 이것들을 저장합니다. 이 마우스, 예를 들어 C57Bl / 6이 필요합니다. 다른 방법은 예를 들어 리 Y 외하여 시각화 실험의 저널에 출판하는 방법, 다른 실험실에…
Representative Results
최종 제품은 그림 3에 표시된 근육 구조 될 것입니다. 조직의 크기는 길이 약 8mm, 폭 2mm와 두께 0.5 mm 될 것입니다. 차별화 동안 전기 자극은 마이 오신 중쇄 isoforms의 표현을 변경되지만, 차별화 매체 (8)에 의해 유도로 크게 차별화 프로세스를 개선하지 않지만, 전기 자극은 근육의 기능을 확인하기 위해 절차의 끝 부분에 적용 할 수 왜냐하면 완전히 개발 sarcomeres와 근육이 전기 펄스에…
Discussion
근육 조직의 공학 재생 의학의 약물 검사에 대한 질병 모델 등과 고기 생산을위한 사용하기위한 잠재력이 있습니다. 그러나 이러한 응용 프로그램에 대한 요구 사항은 다양합니다. 콜라겐은 세포 정렬이 가능하기 때문에 이전의 2D 연구 12 결정 myoblast의 전구 세포는 지하 막 파생 된 단백질의 존재를 필요로하기 때문에 우리는 콜라겐과 matrigel의 조합과 협력하기로 결정했습니다. 또한, 섬…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 배양 그림 2에 표시되는 조직을위한 Yabin 우 감사 할 사진이 바트 반 Overbeeke로 촬영되었다. 작품은 재정적 SenterNovem, 교부금 ISO 42022에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 – 1,1 mm | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 – 1,6 mm | |
| Pasteur pipette | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
Referências
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van der Schaft, D. W. J., van Spreeuwel, A. C. C., Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267, doi:10.3791/4267 (2013).