Engineering Skelettmuskulatur Vävnader från murinceller myoblast progenitorceller och tillämpning av elektrisk stimulering
Summary
Konstruerad muskelvävnad har stor potential i regenerativ medicin, som sjukdomsmodell och även som en alternativ källa för kött. Här beskriver vi konstruktion av en muskel konstruktion, i detta fall från stamceller mus myoblast celler, och stimulering av elektriska pulser.
Abstract
Engineered muskelvävnad kan användas för flera olika ändamål, som innefattar framställning av vävnader för användning som en sjukdom modell in vitro, t.ex. för att studera trycksår, för regenerativ medicin och som ett kött alternativ 1. De första rapporterade 3D muskel konstruktioner har gjorts för många år sedan och pionjärer på området är Vandenburgh och kollegor 2,3. Framstegen i muskelvävnad teknik är inte bara ett resultat av den stora vinsten i kunskap om biokemiska faktorer, stamceller och progenitorceller, men är framför allt baserade på insikter av forskare som fysiska faktorer spelar viktiga roller i kontrollen av cellens beteende och vävnadsutveckling. State-of-the-art konstruerade muskel konstruerar för närvarande består av cell-befolkade hydrogel konstruktioner. I vårt labb dessa består i allmänhet av murina celler myoblast progenitorceller isolerade, från murina bakbenen muskler eller en murin myoblast cellinje C2C12, MIfixerad med en blandning av kollagen / Matrigel och ströks mellan två förankringspunkter, imitera muskeln ligament. Andra celler kan betraktas också, t.ex. alternativa cellinjer som L6 råtta myoblaster 4, neonatal muskel härledda progenitorceller 5, celler som härrör från vuxna muskelvävnad från andra arter såsom människa sex eller till och med inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) 7 . Cell kontraktilitet orsakar inriktning av cellerna längs den långa axeln av konstruktionen 8,9 och differentiering av muskelceller progenitorceller efter ungefär en vecka av odling. Dessutom kan tillämpningen av elektrisk stimulering förbättra processen av differentiering i viss mån 8. På grund av sin begränsade storlek (8 x 2 x 0,5 mm) kan hela vävnaden analyseras med hjälp konfokalmikroskopi för att övervaka t.ex. lönsamhet, differentiering och celljustering. Beroende på den specifika tillämpningen kraven för engineeröd muskelvävnad varierar, t.ex. användning för regenerativ medicin kräver upp skalning av vävnad storlek och vaskularisering, medan att fungera som en kött alternativ översättning till andra arter är nödvändiga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den konstruktion av muskelvävnad har stor potential för användning som en sjukdom modell för läkemedelsscreening i regenerativ medicin och för köttproduktion. Men kraven för dessa applikationer varierar. Vi valde att arbeta med en kombination av kollagen och Matrigel, eftersom kollagen möjliggör celljustering och eftersom myoblast progenitorceller kräver närvaro av källare härledda membranproteinerna som bestämts i tidigare studier 2D 12. Dessutom har fibringeler testats i vårt laboratorium oc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Yabin Wu för odling av vävnader som presenteras i figur 2, var bilden tagits av Bart van Overbeeke. Arbetet stöds ekonomiskt av SenterNovem, bevilja ISO 42022.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 – 1,1 mm | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 – 1,6 mm | |
| Pasteur pipette | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
Referências
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
