Summary
已经建立一个高效的全基因组单基因突变的方法使用
Abstract
转座子突变和单基因缺失的两种方法适用于全基因组基因敲除细菌1,2。虽然转座子诱变是耗时更少,成本更低,并且不需要完成的基因组信息,在该方法中有两个缺点:(1)在该混合反选择竞争降低的突变体的突变体库的一个完全不同的突变体的可能性;和(2)的部分的基因失活的可能性,即基因的不完全失去的转座子的插入后,它们的功能。单基因的缺失分析可能补偿相关的缺点与转座子诱变。为了提高效率的全基因组的单基因缺失,我们尝试建立了高通量技术的使用链球菌血统作为模式生物的全基因组单基因缺失。每个基因缺失构建S.血统基因组被设计成包括1-kb的上游的靶基因,APHA-3基因,编码卡那霉素抗性的蛋白质,和1-kb的下游的靶基因。分别三套引物F1/R1 F2/R2和F3/R3,设计并合成用于PCR扩增这三个组成部分的每个删除构建在96孔板中的格式。引物R1和F3包含25-bp的序列的APHA-3基因在它们的5'末端的区域是互补的。执行一次创建所有的单基因缺失构建一个大型的APHA-3基因的 PCR扩增。 APHA-3基因的启动子的初步排除卡那霉素磁带,以减少潜在的极性效应。要创建的基因缺失构建,高吞吐量的PCR扩增和纯化是在96孔板中的格式进行。线性每个基因缺失的重组PCR扩增子将通过4采用高保真DNA聚合酶的PCR反应。最初的expon差分生长阶段的S.血统 Todd Hewitt肉汤培养在补充有2.5%灭活的马血清是用来增加PCR的重组构建体的转化能力。在此条件下,高达20%的S.血统细胞可以使用〜50ng的DNA转化。根据此方法,2048个单基因缺失的突变体,最终获得的2270个基因在S.血统不包括4个基因的ORF完全包含在其他的ORF S.血统 SK36和218潜在的必需基因。该技术是高通量基因缺失结构,可以很容易使用任何变形菌的全基因组的单基因缺失。
Protocol
1。引物设计
- 引物的设计采用了内部脚本的基础上的S.血统的 SK36基因组序列。三套引物,F1/R1,F2/R2和F3/R3被设计用于扩增的1-kb的上游序列的靶基因,APHA-3基因编码卡那霉素抗性(公里R)蛋白3和1 -kb的下游序列的靶基因,分别( 图1)。在这些引物中,F1和R 3的设计采用ePrimer3 EMBOSS套件的方案( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html )扩增侧翼区的上游或下游的目标基因。基因特异性引物,R 1和F3,设计根据的5'和3'序列的靶基因。 R1和F3引物包含25 bp的适配器,在其5'末端的序列是互补的APHA-3的基因。各引物的熔化温度被设计为尽可能接近到60℃,以使均匀的退火温度可用于所有PCR反应在96孔格式的使用。
- F1,F3,R1和R3引物合成的基因顺序的基础上在96 - 孔板中。每块板包含一种类型的引物在相同的基因顺序。稀释在96 - 孔工作引物板的引物进行PCR扩增,使用多道移液器中至最终浓度为10μM。
2。高通量PCR扩增,纯化
- 以高通量扩增出1 kb的上游或下游的目标S.血统基因,组装的PCR鸡尾酒混合物在冰中含有1640微升DDH 2 O,250微升10xHigh富达PCR缓冲液,200微升10mM的dNTP混合液,加入100μl的50 mM MgSO 4干燥 ,加入100μl的15毫升锥形管10 ng /μl的S。血统 SK36的基因组DNA和10μl的Taq DNA铂polymeRASE高的保真度和传输23微升的混合物中,每孔96孔PCR板,使用多道移液器。 1微升每个F1和R1(或F3和R3)的传输工作引物板的PCR板使用多道移液器从10μM。密封PCR板和执行放大,在94℃1分钟,30个循环的94℃30秒,54℃下为30秒和68℃1.5分钟。
- 准备1%琼脂糖凝胶含有溴化乙锭的48孔嵌合多道移液器装载。 4微升的PCR产物用1微升5xDNA样缓冲液混合,在96孔板上,并加载在琼脂糖凝胶上的样品,使用10微升的多道移液器。运行在135 V电泳30分钟。检查带凝胶,UVP记录和分析系统。
- 纯化的PCR产物由96 PureLink PCR纯化试剂盒,根据制造商的指示的使用离心。为了洗脱DNA,加入40μl的无菌DDH 2 O的B井inding板。
- 随机挑选几个纯化扩增板使用的NanoDrop分光光度计检查的DNA浓度。铭牌上的扩增子的浓度调节到〜10纳克/微升。
- 消化的质粒公里ŕ磁带使用ECOR我作为PCR模板。消化的质粒通过QIAquick PCR纯化试剂盒纯化和线性质粒DNA被调整到最终DNA浓度10纳克/微升。组装25微升混合物公里ŕ盒扩增子包括16.4微升DDH 2 O,2.5微升10xHigh富达PCR缓冲液,2微升10mM的dNTP混合液,1微升的50mM的Mg SO 4,10μMF2,1微升1微升10μM的R2,1微升的线性质粒DNA和0.1微升白金的Taq DNA聚合酶的高保真度。进行PCR扩增,在94℃1分钟,30个循环的94℃30秒,55℃下为30秒和68℃下进行1分钟。检查的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。蒲慕明洛杉矶大部分的Kmŕ由10个独立的PCR纯化QIAquick PCR纯化试剂盒磁带扩增子。调整的扩增子浓度为10 ng /μL。
- 以得到最终的线性重组PCR扩增子,3个PCR扩增子相结合,与每1微升(几乎相等的摩尔量),在一个PCR板以及作为PCR模板。其他PCR成分被添加,包括14.4微升DDH 2 O,2.5微升10xHigh富达PCR缓冲液,2微升10mM的dNTP混合液,1微升的50mM的Mg SO 4,10μM的F1,1微升1微升10μM的R3, 0.1μL铂金的Taq DNA聚合酶高的保真度。 PCR扩增在94℃下进行30秒55℃2分钟,30个循环的94℃下为30秒和68℃3.5分钟,最后68℃4分钟。
- 检查PCR产物在琼脂糖凝胶上。如上所述净化和量化的PCR扩增子。冻结重组PCR扩增产物在-20°C。
3。 COMpetent的制备
- Todd Hewitt肉汤制备,调节pH值至7.6,用10 1N的NaOH,加热至沸腾,然后冷却至室温,并灭菌过滤器4使用0.22微米聚苯乙烯。加入300μl的热灭活马血清(终浓度为2.5%)至11.7毫升Todd Hewitt肉汤15毫升锥形管,以弥补TH + HS介质。等分试样TH + HS介质到2毫升和10毫升管中。
- 接种5μL的股票S.血统 SK36到2ml TH + HS介质和在-80℃下冻结,孵育培养过夜封端紧紧地在37℃下,伴随着预孵育10毫升TH + HS管。
- 过夜后,转移到10ml TH + HS50μl的文化,管在37℃下孵育3小时(对应0.07-0.08的OD 660),立即使用用于转化。
4。细胞转化和抗生素的选择
- 加入2μl70毫微克S.血统 SK36 COMPE唐塞刺激肽(CSP)和2微升线性重组PCR扩增子(〜50毫微克)到Eppendorf管中,在96孔块和预暖它们在37℃下每管330μl的3小时孵育SK36文化的转移。在37℃下孵育1小时。替换DNA,用无菌DDH 2 O控制。
- 块放置在冰上,并与500微克/毫升卡那霉素的脑心浸液(BHI)琼脂平板上传播100μl的每个变换。在37°C孵育板微氧条件下为2天。
5。突变的确认和存储
- 每次更换突变体,随机挑选2个单个菌落,接种到5毫升BHI为500μg/ ml卡那霉素的殖民地和孵化接种microaerobically隔夜在37°C。 30%的甘油冷冻保存每一种文化在-80°C
- 要检查是否包含预期的基因替代突变体,每一个突变F1进行菌落PCR和R3引物在96孔PCR板。约1微升过夜培养从单个菌落作为模板DNA的25微升的PCR扩增反应中使用。进行PCR,在94℃5分钟,35个循环的94℃下30秒,55℃3.5分钟,最后68℃下4分钟为30秒和68℃下进行。
- 为了精确地确定双波段的突变体或污染物的PCR扩增,通过电泳检查PCR扩增子,在> 12厘米长的2%琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色的4小时。这琼脂糖凝胶电泳条件下,任何扩增产物≥100 bp的差异进行明确标识。当频带从公里ŕ盒扩增的野生型基因所产生的预期<100,一个内部的T1引物使用,以确定是否可以通过PCR检测的野生型基因的沸点不同。
- 为了进一步确认删除时,PureLink 96 PCR纯化试剂盒纯化,扩增子的使用P1引物和测序结合公里ŕ盒。只保留正确的突变体经测序证实。
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Representative Results
经过PCR扩增用引物F1和R1,和F3和R3,约1 kb的上游和下游的每个S.血统基因中得到的96孔板的形式,分别为( 图2A)。在我们的PCR条件下,使用设计引物,扩增特定产品的S.血统每个PCR反应中的基因组DNA。此结果表明,该引物对具有高度特异性的目标的S.血统 。通过PCR扩增使用F1和R3引物和3扩增子作为DNA模板,线性的重组PCR构造(〜3 kb的)的高通量的96孔板中,组成的一个区域的每一个目标基因,卡那霉素的上游侧上创建磁带盒,并在该顺序( 图2B)中的每个靶基因的下游区域。重组PCR结构,然后转化为S.血统 SK36和卡那霉素BHI琼脂平板上选择。对于大多数的变换,的rmations,超过1000个殖民地获得每块板后,一个微氧2天孵化。当这些菌落PCR扩增使用F1和R3,一个单一的DNA条带,对应于预期的突变尺寸(〜3 kb的)观察通过凝胶电泳( 图2C)。当试图以删除潜在的必需基因,没有菌落可以以下方式获得在广大的转换。然而,对于一些重要的基因删除,菌落仍然得到下面的转换。使用F1/R3这些菌落的PCR扩增后,两个DNA条带,对应于预期的突变的大小和野生型大小似乎所揭示的凝胶电泳( 图2C)。对于某些突变体,预期的突变体的尺寸和大小的PCR扩增子的野生型太靠近长琼脂糖凝胶分离。在这种情况下,内部引物T1的目的是根据野生型的基因序列。进行PCR,使用内部的T1引物a届F1引物( 图2D)。被用来作为该PCR的阳性对照菌株的野生型SK36。如果与预期大小的频带从突变使用内部引物进行扩增,该基因被标识为必需基因(双波段突变)以来的突变体中的卡那霉素盒的存在下,,先前使用P1引物通过DNA测序证实。根据此协议,我们最终收集了2048非必要S.血统基因突变不包括4个ORF完全包含在其他的开放阅读框( 表1)。我们发现有218个基因是必不可少的S.血统的实验条件下生存。
类 | 开放阅读框(ORF) |
基因总数* | 2270 |
有针对性的基因 | 2266 |
非必需(启动子APHA-3) | 1973年 |
不重要的(子APHA-3) | 75 |
基本(没有转化) | 60 |
必要的(双波段) | 158 |
*四的ORF完全包含在其他的ORF。
表1中。S.血统基因突变的总结。
图1。重组PCR三套引物(F1/R1 F2/R2和F3/R3)设计用于扩增的药物抗性基因(公里R)和下游序列的上游序列,分别。 R1和F3引物的5'末端包含序列共同mplementary与盒的抗生素抗性基因。最后一个PCR重组DNA产品含有抗生素选择标记两侧S.的生产采用F1/R3 血统的基因组DNA。重组DNA将被纳入S.血统基因组通过双交叉重组。
图2代表的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳。 A,1-kb的PCR扩增子的上游或下游的目标S。血统基因。 B,组成的上游和下游的靶基因和启动子的APHA-3的重组DNA的PCR。 C,菌落PCR扩增产物的改造S.用PCR的重组DNA 血统 ,在第4泳道,10,14,15,20和24的双波段。 D,PCR扩增的野生型和突变型的菌落,用引物F1/T1,M,突变体,W,野生型。
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Discussion
为了尽量减少可能的极性的影响1与外源性抗生素基因对邻近基因的靶基因的更换,采取两个步骤,而最初的引物设计。对于大多数已删除的基因,引物R1和F3被设计用于删除后的6个碱基的30 bp的起始密码子到终止密码子之前的编码区。最后保留了30个碱基对,以保护潜在的使用相邻的下游基因的核糖体结合位点。两个相邻的基因之间的保留区域被扩展到100 bp的,当他们位于相反方向,这两种蛋白的N-末端是彼此接近,以防止删去一个潜在的启动子区域。 APHA-3基因的启动子被排除在重组构建基因缺失5。甲核糖体的结合位点被引入用于翻译的APHA-3基因。为了测试我们的战略,我们随机构造的10和96个等位基因交换突变体。我们Øbtained,表明该启动子的APHA-3基因有人以及在大多数情况下,10和93的突变体,分别在卡那霉素选择板上。然后,我们设计并合成引物启动子APHA-3基因,所有的基因缺失的S.血统基因组。然而,我们发现了一些基因在S.血统低表达或不表达,这可能会影响APHA-3基因的启动子,因此在卡那霉素选择的表达。为了解决这个问题,APHA-3基因启动子的质粒引入公里ŕ盒。 ŕ的启动公里磁带扩增子的散装获得10个独立的PCR用引物F2p/R2。不同之处在于新的R1启动子的引物被设计为与启动子公里ŕ盒扩增子补充R1p,所有其他构建步骤是相同的启动子减少建筑。
为了提高效率运行y的同源重组中,我们选择长(1 kb的)上游和下游的侧翼序列的S.血统靶基因的基因缺失构建。 1 kb的两个点的基础上的侧翼序列的大小是有限的:(1)的DNA片段的长度(〜3 kb的)允许准备PCR扩增的APHA-3基因(约1 kb的)加2 kb的侧翼序列使用高保真DNA聚合酶;和(2)从两端(〜1 kb的)由ABI测序法测序侧翼区的可行性。高的转化数中的大部分的S.血统基因缺失表明1 kb的上游和下游序列,分别为足够的靶基因敲除。
要成功地连接的上游和下游的靶基因与APHA-3基因的PCR重组扩增,引物R1,F2,R2和F3的两端将被添加在其5'端的conn一个额外的序列,该序列互补ecting许多细菌基因缺失例6,7中的另一侧的端部。初步研究表明,可以减少到25 bp的此重组PCR协议的额外序列。在这个协议中,我们消除了额外的序列的引物F2和R2在APHA-3基因,并添加25-bp的额外的序列的5'-末端的R1和F3在上游和下游的S.血统的靶基因。这样的设计会降低引物的长度和数量,从而降低成本和在PCR次单基因缺失,以提高效率。在我们的实验室中,这样的设计也被成功地展示了其他细菌如变形链球菌 , 肺炎链球菌 , 牙龈卟啉单胞菌基因缺失。
在这个协议中,PCR引物的特异性是关键的。的引物的熔融温度高(> 58℃),引物的大小为长(> 21 bp的),和引物:双向nding网站的时间是在基因组中独一无二的S.血统 。这样的设计在几乎每一个我们的PCR扩增单个基因的特定产品。一个单一的特定基因的PCR扩增产物是关键的最后的PCR扩增。否则,最终的PCR扩增,结果在形成最终的重组组成的每个基因的上游和下游区域和抗生素的基因盒,分别将是困难的。
细胞密度依赖的转型已被证明在许多链球菌,如S.血统,S.变形链球菌和S.肺炎 10。当细胞密度的S.血统达到的OD 660 0.07-0.08(对应到〜5×10 6 CFU /毫升)在TH + HS介质,最高的转化效率的S.血统得到具有线性的重组PCR扩增子,和高达20%的S.血统细胞可以被转换。完成后的全基因组基因缺失S.血统 ,我们发现,删除一些不必要的基因的转化体的数目是低的(〜10)。毫无疑问,高转化效率的细菌,以满足所有的非必需基因缺失的全基因组基因敲除技术是很重要的。
除了通过PCR重组结构创造单基因失活,也有其他的技术。例如,自杀质粒创建以来,一直广泛适用于细菌基因失活在小范围内。然而,该技术并没有被使用的全基因组的单一的基因失活,因为大型质粒创造是非常耗时且费力的,和一些细菌需要创建特定的自杀质粒。虽然标记的基因缺失可能避免可能的抗生素抗性基因的极性效应,传统的标记的基因缺失的方法是更多的时间供应梁漱溟和难以灭活的基因比自杀质粒的方法。在大肠杆菌中,已获得的全基因组标记基因缺失通过更换与抗生素抗性基因,然后消除的抗性盒6。然而,这种大肠杆菌coli菌株需要的λ噬菌体Red重组酶。基因删除转型前,红的辅助质粒pKD46应引入E.大肠杆菌 11。我们的技术,我们消除了APHA-3抗性基因的启动子在绝大多数的基因缺失突变株,并设计了两个端APHA-3 ORF遵循的表达的基因缺失区域结构,避免极性的抗性基因的影响问题。到现在为止,我们还没有发现极性效应的问题,在研究这项技术所创造的许多突变体的功能。在S.必需基因的全基因组和一套明确的收购血统使用次技术12还意味着系统中的抗生素的磁带盒的极性效应的可能性低。我们已经证明其他发起人的抗生素抗性基因,如红霉素,氯霉素抗性基因,可以采用在该技术中(数据未示出)。此外,这种技术不需要的自杀质粒和重构主机。总体而言,此技术是创建的全基因组基因缺失构建和在全基因组的单基因突变的细菌,可以很容易执行的高吞吐量。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的补助金从美国国立卫生(PX)和R01DE018138部分,弗吉尼亚联邦大学校长科研奖励计划(PRIP)144602-3(PX)。我们感谢博士。雷震,西城区月坛窦和小静王为协助建设的全基因组突变体。我们也感谢的DNA核心设施在弗吉尼亚联邦大学进行DNA测序。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
Agarose | Promega | V3125 | |
BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
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