Summary
एक कुशल जीनोम चौड़ा एक जीन उत्परिवर्तन विधि का उपयोग कर स्थापित किया गया है
Protocol
1. प्रथम डिजाइन
- प्राइमर्स एस के आधार पर घर लिपियों में उपयोग के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं sanguinis SK36 जीनोम अनुक्रम. प्राइमरों, F1/R1, F2/R2, और F3/R3 के तीन सेट 1 केबी लक्ष्य जीन, जीन एन्कोडिंग APHA-3 केनामाइसिन (कि.मी. r) 3 प्रोटीन प्रतिरोध और 1 के अपस्ट्रीम अनुक्रम के प्रवर्धन के लिए तैयार हैं लक्ष्य जीन, क्रमशः केबी बहाव के अनुक्रम (1 चित्रा). F1 और R3 इन प्राइमरों के अलावा, कार्यक्रम के सुइट एम्बॉसफ़िल्टर (ePrimer3 का उपयोग कर डिज़ाइन कर रहे हैं http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) flanking क्षेत्रों लक्ष्य के ऊपर या नीचे की ओर बढ़ाना जीन. जीन विशिष्ट प्राइमरों, R1 और F3, 5 और 3 'लक्ष्य जीन के दृश्यों पर आधारित डिजाइन किए हैं. R1 और F3 प्राइमरों अपने 5 'के अंत में 25-बीपी अनुकूलक दृश्यों कि APHA-3 के लिए पूरक हैं होते हैंजीन. प्रत्येक प्राइमर के पिघलने के तापमान के रूप में करीब 60 के लिए संभव ° C 96 प्रारूप में सभी पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए तापमान annealing वर्दी के उपयोग को सक्षम. तैयार हो रहे थे
- F1, R1 F3, और R3 प्राइमरों 96-अच्छी तरह से एक जीन के आदेश के आधार पर प्लेटों में संश्लेषित कर रहे हैं. हर प्लेट एक ही जीन के क्रम में प्राइमरों एक प्रकार होता है. पीसीआर प्रवर्धन के लिए एक 10 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता एक multichannel विंदुक का उपयोग करने के लिए 96-अच्छी तरह से काम कर रहा प्राइमर थाली में प्राइमरों पतला.
2. उच्च throughput पीसीआर प्रवर्धन और शुद्धीकरण
- उच्च throughput बढ़ाना 1 केबी नदी के ऊपर या लक्ष्य एस के बहाव sanguinis जीन, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार 1640 μl DDH 2 हे, 250 μl 10xHigh फिडेलिटी पीसीआर बफर, 10 मिमी dNTP मिश्रण की 200 μl, 50 मिमी की 100 μl MgSO 4, 100 के μl युक्त ट्यूब में बर्फ पर एक पीसीआर कॉकटेल मिश्रण को इकट्ठा 10 एनजी / μl एस sanguinis SK36 जीनोमिक डीएनए और 10 μl प्लेटिनम Taq डीएनए polymeमलियामेट करना उच्च निष्ठा और प्रत्येक कुएं में मिश्रण के 23 μl हस्तांतरण 96-अच्छी तरह से पीसीआर थाली पर एक multichannel विंदुक का उपयोग. Multichannel विंदुक का उपयोग पीसीआर थाली करने के लिए 10 प्राइमर प्लेटें काम सुक्ष्ममापी से प्रत्येक F1 और R1 (या F3 और R3) की 1 μl स्थानांतरण. पीसीआर थाली सील और 94 डिग्री सेल्सियस पर प्रवर्धन 1 मिनट और 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 54 डिग्री सेल्सियस के लिए 1.5 मिनट के लिए 30 सेकंड और 68 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रदर्शन.
- 1% agarose जेल ethidium ब्रोमाइड युक्त 48 कुओं फिटिंग multichannel विंदुक लदान के साथ तैयार है. 96 अच्छी तरह से थाली पर 5xDNA लोडिंग बफर के 1 μl के साथ 4 μl पीसीआर उत्पाद और मिक्स लोड agarose जेल पर नमूने एक multichannel 10 μl विंदुक का उपयोग. 135 वी में 30 मिनट के लिए वैद्युतकणसंचलन चलाएँ. UVP प्रलेखन और विश्लेषण प्रणाली के तहत जेल पर बैंड की जांच करते हैं.
- PureLink 96 पीसीआर शुद्धि centrifugation निर्माता अनुदेश के अनुसार किट का पीसीआर उत्पादों शुद्ध. डीएनए eluting के लिए, ख की अच्छी तरह से करने के लिए 40 μl बाँझ DDH 2 हेथाली inding.
- अनियमित थाली पर कई शुद्ध amplicons लेने NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने के लिए डीएनए सांद्रता की जांच. थाली पर amplicons की एकाग्रता को समायोजित करने के लिए ~ 10 एनजी / μl.
- पू.त. रेलवे मैं पीसीआर टेम्पलेट के रूप में उपयोग एक प्लाज्मिड युक्त किमी r कैसेट पच जाता है. पचा प्लाज्मिड QIAquick पीसीआर शुद्धि किट द्वारा शुद्ध होता है और रैखिक प्लास्मिड डीएनए 10 एनजी / μl अंतिम डीएनए एकाग्रता के लिए निकाला जाता है. अतः इकट्ठा किमी r कैसेट सहित amplicon 16.4 μl DDH 2 हे, 2.5 μl 10xHigh फिडेलिटी पीसीआर बफर, 10 मिमी dNTP मिश्रण के 2 μl, 50 मिमी मिलीग्राम की 1 μl के लिए 25 μl मिश्रण 4, 10 F2, 1 की μl सुक्ष्ममापी के 1 μl 10 सुक्ष्ममापी R2, 1 μl रैखिक प्लास्मिड डीएनए और 0.1 μl प्लेटिनम Taq डीएनए पोलीमरेज़ उच्च विश्वस्तता. 94 डिग्री सेल्सियस पर 30 और 68 सेकंड के लिए 1 मिनट और 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस के लिए पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन ° C 1 मिनट के लिए. पर 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पीसीआर उत्पाद की जांच करते हैं. पूला थोक QIAquick पीसीआर शुद्धि किट द्वारा किलोमीटर r 10 व्यक्ति पीसीआर विशुद्ध से कैसेट amplicon. 10 एनजी / μl amplicon एकाग्रता समायोजित करें.
- अंतिम रैखिक रीकॉम्बीनैंट पीसीआर amplicon प्राप्त करने के लिए, तीन पीसीआर amplicons एक पीसीआर पीसीआर टेम्पलेट के रूप में अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक 1 μl (लगभग बराबर दाढ़ मात्रा में) के साथ जोड़ा जाता है. अन्य पीसीआर घटकों 14.4 μl DDH 2 हे, 2.5 μl 10xHigh फिडेलिटी पीसीआर बफर, 10 मिमी dNTP मिश्रण के 2 μl, 50 मिमी मिलीग्राम की 1 μl सहित जोड़ा जाता है तो 4, 10 सुक्ष्ममापी F1 की 1 μl, 10 सुक्ष्ममापी R3 की 1 μl 0.1 μl प्लेटिनम Taq डीएनए पोलीमरेज़ उच्च विश्वस्तता. पीसीआर प्रवर्धन 2 मिनट, 94 चक्र के 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है 30 सेकंड 55 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 सेकंड और 68 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 मिनट के लिए 3.5 मिनट, और अंत में 68 डिग्री सेल्सियस के लिए.
- Agarose जेल पर पीसीआर amplicons जांच करते हैं. शुद्ध और पीसीआर amplicons यों के रूप में ऊपर वर्णित है. -20 डिग्री सेल्सियस में recombined पीसीआर amplicons स्थिर
3. कॉमpetent कोशिकाओं तैयारी
- टोड हेविट शोरबा तैयार है, 7.6 10 एन NaOH, फोड़ा करने के लिए और फिर कमरे के तापमान पर ठंडा और 0.22 सुक्ष्ममापी polystyrene 4 फिल्टर का उपयोग निष्फल गरम का उपयोग कर समायोजित पीएच. 11.7 मिलीलीटर टोड हेविट शोरबा 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 300 μl गर्मी निष्क्रिय घोड़ा सीरा (2.5% करने के लिए अंतिम एकाग्रता) वें + एच एस मध्यम जोड़ें. अशेष भाजक + TH 2 मिलीग्राम और ट्यूबों में 10 मिलीलीटर में एच एस मध्यम.
- स्टॉक एस 5 μl टीका लगाना sanguinis SK36 2 मिलीलीटर वें + एच एस मध्यम में -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं और 37 पर कसकर कैपिंग के साथ रातोंरात संस्कृति डिग्री सेल्सियस, पूर्व 10 मिलीलीटर वें + एच एस ट्यूब incubating के साथ सेते हैं.
- रातोंरात के बाद, 10 मिलीलीटर TH + एच एस में 50 μl संस्कृति हस्तांतरण और 3 घंटा (इसी 0.07-0.08 के आयुध डिपो 660) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं, तुरंत परिवर्तन के लिए उपयोग.
4. सेल परिवर्तन और एंटीबायोटिक चयन
- 70 एनजी एस के 2 μl जोड़ें sanguinis SK36 compeटेनसे उत्तेजक पेप्टाइड (CSP) और 2 μl रैखिक रीकॉम्बीनैंट पीसीआर Eppendorf ट्यूबों को (~ 50 एनजी) 96-अच्छी तरह से ब्लॉक और उन्हें पूर्व गर्म पर 37 amplicon डिग्री सेल्सियस प्रत्येक ट्यूब में 3 घंटे incubated SK36 संस्कृति की 330 μl स्थानांतरण. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. बाँझ DDH 2 हे नियंत्रण के रूप में डीएनए के साथ बदलें.
- बर्फ पर ब्लॉक प्लेस और मस्तिष्क दिल (BHI) जलसेक अगर प्लेट पर 500 छ / मिलीलीटर केनामाइसिन साथ प्रत्येक परिवर्तन के 100 μl फैल गई. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें microaerobic शर्तों के तहत 2 घ के लिए सेते हैं.
5. उत्परिवर्ती पुष्टि और संग्रहण
- प्रत्येक प्रतिस्थापन उत्परिवर्ती के लिए बेतरतीब ढंग से 2 व्यक्ति कालोनियों लेने, 5 मिलीग्राम BHI 500 छ / मिलीलीटर केनामाइसिन युक्त में कॉलोनी टीका लगाना और inoculum 37 पर microaerobically रातोंरात सेते हैं डिग्री सेल्सियस -80 में 30% ग्लिसरॉल में प्रत्येक संस्कृति Cryopreserve डिग्री सेल्सियस
- जांच करने के लिए कि क्या उम्मीद जीन प्रतिस्थापन युक्त उत्परिवर्ती, प्रत्येक उत्परिवर्ती F1 का उपयोग कर के लिए कॉलोनी पीसीआर और R3 प्रदर्शन96-अच्छी तरह से पीसीआर थाली में प्राइमरों. के बारे में 1-μl व्यक्तिगत कॉलोनी से रातोंरात संस्कृति 25 μl प्रतिक्रिया पीसीआर प्रवर्धन डीएनए टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है. पीसीआर 94 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 94 की 35 चक्र ° सी के लिए किया जाता है, 30 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 और 68 सेकंड के लिए डिग्री सेल्सियस 3.5 मिनट, और 4 मिनट के लिए अंत में 68 डिग्री सेल्सियस के लिए.
- ठीक डबल बैंड म्यूटेंट या contaminant पीसीआर amplicon की पहचान, वैद्युतकणसंचलन द्वारा> 12 सेमी लंबी ethidium ब्रोमाइड धुंधला के साथ 2% agarose जेल पर 4 घंटे के लिए पीसीआर amplicon की जांच. इस agarose जेल वैद्युतकणसंचलन हालत के तहत, ≥ 100 बीपी अंतर के साथ किसी भी amplicons स्पष्ट रूप से पहचान की गई. जब बैंड किमी r कैसेट के प्रवर्धन और जंगली प्रकार के जीन से उत्पन्न <100 बीपी, एक आंतरिक T1 प्राइमर के लिए तय है कि एक जंगली प्रकार के जीन पीसीआर के द्वारा पाया जा सकता है के लिए प्रयोग किया जाता है से अलग करने के लिए प्रत्याशित हैं.
- आगे हटाए जाने की पुष्टि करने के लिए amplicons PureLink 96 पीसीआर शुद्धि किट द्वारा शुद्ध कर रहे हैं और P1 प्राइमर जो का उपयोग कर अनुक्रमकिमी r कैसेट बांधता है. केवल सही अनुक्रमण द्वारा पुष्टि म्यूटेंट रखें.
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Representative Results
बाद पीसीआर प्रवर्धन प्राइमरों F1 और R1 का उपयोग करते हुए, और F3 और R3, लगभग 1-केबी नदी के ऊपर और प्रत्येक एस के नीचे sanguinis जीन 96-प्रारूप, क्रमशः (2A चित्रा) में प्राप्त किया गया. हमारे पीसीआर शर्तों और का उपयोग कर बनाया प्राइमरों के तहत, एक विशिष्ट उत्पाद एस से परिलक्षित किया गया था प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में sanguinis जीनोमिक डीएनए. इस परिणाम संकेत दिया प्राइमरों उच्च एस के लक्ष्य के लिए विशिष्ट थे sanguinis. पीसीआर के माध्यम से F1 और R3 प्राइमरों और डीएनए टेम्पलेट्स, रैखिक रीकॉम्बीनैंट पीसीआर constructs (~ 3 केबी) के रूप में तीन amplicons का उपयोग कर रहे हैं प्रवर्धन उच्च throughput 96 अच्छी तरह से थाली, एक क्षेत्र के प्रत्येक लक्ष्य जीन, एक केनामाइसिन के अपस्ट्रीम से बना पर बनाया गया था कैसेट, और उस आदेश (चित्रा 2B) में प्रत्येक लक्ष्य जीन का एक क्षेत्र अनुप्रवाह. रीकॉम्बीनैंट पीसीआर constructs तो एस में तब्दील हो गया SK36 sanguinis और भी अगर प्लेट पर केनामाइसिन द्वारा चयनित. Transfo के बहुमत के लिएrmations, 1000 कालोनियों पर एक थाली पर एक microaerobic घ ऊष्मायन 2 के बाद प्राप्त किया गया. जब इन कालोनियों F1 और R3, एक एकल डीएनए उम्मीद उत्परिवर्ती आकार (~ 3 केबी) जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 2C) द्वारा मनाया गया था इसी बैंड का उपयोग कर रहे थे पीसीआर प्रवर्धित. जब संभावित आवश्यक जीन को हटाने का प्रयास, कोई कालोनियों परिवर्तनों के बहुमत में प्राप्त किया जा सकता है. कुछ आवश्यक जीन का विलोपन के लिए, तथापि, कालोनियों अभी भी निम्न परिवर्तन प्राप्त किया गया. पीसीआर प्रवर्धन के इन F1/R3 का उपयोग कर कालोनियों के बाद दिखाई दिया, दो डीएनए उत्परिवर्ती आकार की उम्मीद करने के लिए इसी बैंड और जंगली प्रकार आकार के रूप में जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 2C) द्वारा पता चला. कुछ म्यूटेंट के लिए, उम्मीद उत्परिवर्ती आकार और पीसीआर amplicon के जंगली प्रकार का आकार भी लंबे agarose जेल के द्वारा अलग किया जा करीब थे. इस मामले में, एक आंतरिक प्राइमर T1 जीन जंगली प्रकार के अनुक्रम के आधार पर बनाया गया था. पीसीआर आंतरिक T1 प्राइमर एक का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया थाएन डी F1 प्राइमर (चित्रा 2 डी). जंगली प्रकार SK36 इस पीसीआर के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के तनाव के रूप में इस्तेमाल किया गया था. यदि अपेक्षित आकार के साथ एक बैंड आंतरिक प्राइमर का उपयोग उत्परिवर्ती से परिलक्षित किया गया था, जीन उत्परिवर्ती में केनामाइसिन कैसेट की उपस्थिति के बाद से आवश्यक जीन (उत्परिवर्ती डबल - बैंड) के रूप में पहचान की गई थी P1 प्राइमर का उपयोग डीएनए अनुक्रमण द्वारा पहले की पुष्टि की. इस प्रोटोकॉल के आधार पर, हम अंततः 2048 गैर जरूरी एस एकत्र sanguinis जीन उन चार अन्य ORFs (1 टेबल) के भीतर पूरी तरह से निहित ORFs छोड़कर म्यूटेंट. हम 218 जीन जो एस के लिए आवश्यक हैं की पहचान प्रयोगात्मक शर्तों के तहत sanguinis अस्तित्व.
वर्ग | ओपन पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) |
कुल जीन * | 2270 |
लक्षित जीन | 2266 |
Nonessential (APHA-3 promoterless) | 1973 |
Nonessential (प्रमोटर APHA 3) | 75 |
आवश्यक (कोई transformant) | 60 |
आवश्यक (डबल बैंड) | 158 |
* चार ORFs अन्य ORFs के भीतर पूरी तरह से निहित है.
तालिका 1 एस. sanguinis जीन उत्परिवर्ती सारांश.
चित्रा 1. संयोजक पीसीआर प्राइमरों के तीन सेट (F2/R2 F1/R1, और F3/R3) को अपस्ट्रीम अनुक्रम, एक दवा प्रतिरोध जीन (कि.मी. r) और बहाव के अनुक्रम, क्रमशः बढ़ाना करने के लिए डिजाइन किए हैं. R1 और F3 प्राइमरों के समाप्त होता है दोनों 5 दृश्यों सह होते हैंएक एंटीबायोटिक प्रतिरोधी जीन की कैसेट साथ mplementary. एक अंतिम पीसीआर पुनः संयोजक डीएनए एंटीबायोटिक चयन मार्कर युक्त उत्पाद एस के साथ flanked sanguinis जीनोमिक डीएनए F1/R3 का उपयोग कर उत्पादन किया है. एस पुनः संयोजक डीएनए में एकीकृत किया जाएगा डबल पुनर्संयोजन पार से अधिक के माध्यम से sanguinis जीनोम.
चित्रा 2 प्रतिनिधि पीसीआर amplicons agarose जेल वैद्युतकणसंचलन. ए, 1 केबी एस अपस्ट्रीम या लक्ष्य के बहाव के पीसीआर amplicons sanguinis जीन. बी, पीसीआर रीकॉम्बीनैंट DNAs अपस्ट्रीम और लक्ष्य जीन के बहाव और promoterless APHA-3 से बना. सी एस के परिवर्तन से, कॉलोनी पीसीआर amplicons sanguinis पीसीआर रीकॉम्बीनैंट DNAs साथ, लेन 4, 10, 14, 15, 20 और 24 में डबल बैंड. विकास, जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती F1/T1 प्राइमरों का उपयोग कालोनियों के पीसीआर प्रवर्धन, एम,उत्परिवर्ती, डब्ल्यू, जंगली प्रकार.
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Discussion
पड़ोसी जीन पर exogenous एंटीबायोटिक दवाओं जीन के साथ एक लक्षित जीन के प्रतिस्थापन के संभव ध्रुवीय प्रभाव को कम करने के लिए, दो कदम जबकि प्रारंभिक प्राइमर डिजाइन ले रहे हैं. हटाए गए जीनों के अधिकांश के लिए, प्राइमरों R1 और F3 6 30 बीपी के लिए शुरू codon रोकने के codon से पहले बीपी से कोडिंग क्षेत्र को नष्ट करने के लिए डिजाइन किए हैं. पिछले 30 आधार जोड़े संभावित ribosomal बाध्यकारी आसन्न बहाव के जीन द्वारा इस्तेमाल साइट की रक्षा के लिए रखा जाता है. दो पड़ोसी जीन के बीच बनाए रखा क्षेत्र 100 बीपी के लिए बढ़ा दिया है जब वे विपरीत झुकाव में स्थित थे और दोनों प्रोटीन के एन टर्मिनी एक संभावित प्रमोटर क्षेत्र को हटाने से रोकने के एक दूसरे के करीब है. APHA तीन जीन के प्रमोटर जीन 5 हटाने के लिए पुनः संयोजक निर्माण में बाहर रखा गया है. अनुवाद के लिए APHA 3 जीन में एक ribosomal बाध्यकारी साइट शुरू की है. हमारी रणनीति का परीक्षण करने के लिए, हम बेतरतीब ढंग से 10 का निर्माण किया और फिर 96 allelic विनिमय म्यूटेंट. हम ओ10 और 93 म्यूटेंट, क्रमशः केनामाइसिन चयन प्लेटों पर, btained, सुझाव है कि प्रमोटर कम APHA-3 जीन ज्यादातर मामलों में अच्छी तरह से व्यक्त किया गया था. हम तो तैयार है और एस में सभी जीन विलोपन के लिए प्रमोटर कम APHA तीन जीन के लिए प्राइमर संश्लेषित sanguinis जीनोम. हालांकि, हम एस में कुछ जीन पाया sanguinis कम या व्यक्त किया गया व्यक्त है जो संभावना APHA promoterless - 3 जीन और इसलिए kanamycin चयन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करेगा नहीं. इस मुद्दे, प्लाज्मिड से APHA तीन जीन के प्रमोटर को हल किमी r कैसेट में पेश किया गया था. प्रमोटर किमी r कैसेट amplicon की एक थोक 10 व्यक्ति पीसीआर से प्राप्त किया गया था प्राइमरों F2p/R2 का उपयोग कर. सिवाय इसके कि नए R1 प्रमोटर प्राइमरों R1p प्रमोटर किमी r कैसेट amplicon साथ पूरक के लिए डिजाइन किए गए थे, अन्य सभी निर्माण कदम प्रमोटर - कम निर्माण के लिए के रूप में ही थे.
करने के लिए efficienc में सुधारमुताबिक़ पुनर्संयोजन के y, हम लंबे समय (1 केबी) flanking दृश्यों एस के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम का चयन करें sanguinis लक्ष्य जीन जीन विलोपन constructs बनाने में. flanking अनुक्रम आकार दो अंक के आधार पर 1 केबी तक ही सीमित था: (1) डीएनए टुकड़ा लंबाई (~ 3 केबी) जीन APHA 3 (~ 1 केबी) के तैयार पीसीआर प्रवर्धन प्लस flanking दृश्यों का उपयोग कर के 2 केबी की अनुमति दी उच्च विश्वस्तता डीएनए पोलीमरेज़, और (2) दोनों सिरों (~ 1 केबी) से अबी अनुक्रमण विधि द्वारा flanking क्षेत्रों अनुक्रमण की व्यवहार्यता. एस के सबसे उच्च में transformants की संख्या sanguinis जीन विलोपन 1 केबी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम दृश्यों का संकेत है, क्रमशः, पर्याप्त थे लक्ष्य जीन पीटा.
सफल अपस्ट्रीम और APHA-3 जीन के साथ समाप्त होता है पीसीआर रीकॉम्बीनैंट प्रवर्धन, प्राइमरों R1, F2, R2 और F3 में दो लक्ष्य जीन के बहाव के अपने '5 में जोड़ा जाएगा कनेक्ट क्ोन के साथ एक अतिरिक्त अनुक्रम कि पूरक है समाप्त होता हैकई जीवाणु जीन विलोपन 6,7 मामलों में दूसरे पक्ष के अंत ecting. प्रारंभिक अध्ययन से पता चला है कि अतिरिक्त अनुक्रम इस पुनः संयोजक पीसीआर प्रोटोकॉल के लिए 25 बीपी को कम किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम APHA-3 जीन में प्राइमरों F2 और R2 के अतिरिक्त दृश्यों का सफाया और R1 और F3 के अंत 5'में 25-बीपी अतिरिक्त अनुक्रम अपस्ट्रीम और एस के बहाव sanguinis लक्ष्य जीन. यह डिजाइन और प्राइमरों की लंबाई राशि कम होती है और इसलिए लागत और पीसीआर समय को कम करने के लिए एकल जीन विलोपन की दक्षता में सुधार. हमारी प्रयोगशाला में, इस डिजाइन भी सफलतापूर्वक किया गया है स्ट्रेप्टोकॉकस म्युटान्स और स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया, और Porphyromonas gingivalis जैसे अन्य रोगाणुओं में जीन विलोपन के लिए प्रदर्शन किया.
इस प्रोटोकॉल में, पीसीआर प्राइमरों की विशिष्टता महत्वपूर्ण है. प्राइमर पिघलने उच्च तापमान (58 डिग्री सेल्सियस), प्राइमर आकार लंबा था (> 21 बीपी), और प्राइमर द्विnding साइट एस के जीनोम में अद्वितीय था sanguinis. इस डिजाइन हमारे पीसीआर amplifications की लगभग प्रत्येक एकल जीन विशिष्ट उत्पादों का उत्पादन. पीसीआर प्रवर्धन से एक एकल जीन विशेष उत्पाद पिछले पीसीआर प्रवर्धन के लिए महत्वपूर्ण है. अन्यथा, अंतिम पीसीआर प्रवर्धन कि प्रत्येक जीन अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम क्षेत्रों और एंटीबायोटिक जीन कैसेट के अंतिम रीकॉम्बीनैंट रचना का गठन में परिणाम, क्रमशः, मुश्किल होगा.
परिवर्तन की निर्भरता सेल घनत्व एस जैसे कई streptococci में प्रदर्शन किया गया है sanguinis 8, एस. 9 अपरिवर्तक और एस. 10 निमोनिया. जब एस के घनत्व सेल sanguinis वें में 0.07-0.08 के एक आयुध डिपो 660 (~ 5x10 6 CFU / एमएल करने के लिए इसी) पहुँचे + एचएस मध्यम, एस के उच्चतम परिवर्तन दक्षता एक रेखीय रीकॉम्बीनैंट पीसीआर amplicon साथ sanguinis प्राप्त किया गया था और एस के 20% sanguinis कोशिकाओंतब्दील किया जा सकता है. जीनोम चौड़ा एस में जीन विलोपन के पूरा होने के बाद sanguinis, हमने पाया कि कुछ nonessential जीन का विलोपन के लिए transformants की संख्या कम थी (~ 10). इसमें कोई शक नहीं है कि जीवाणुओं की उच्च परिवर्तन दक्षता जीनोम चौड़ा जीन knockouts में nonessential जीन विलोपन के सभी को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है.
सिवाय पीसीआर द्वारा रीकॉम्बीनैंट निर्माण रचना के लिए, वहाँ भी एकल जीन निष्क्रियता के लिए अन्य तकनीकों. उदाहरण के लिए, आत्महत्या प्लाज्मिड निर्माण किया गया है बड़े पैमाने पर करने के लिए एक छोटे पैमाने पर जीवाणु जीन को निष्क्रिय करने के लिए लागू होता है. हालांकि, इस तकनीक जीनोम चौड़ा एक जीन निष्क्रियता के लिए नहीं इस्तेमाल किया गया है क्योंकि बड़े पैमाने पर प्लाज्मिड निर्माण बहुत समय लेने वाली और श्रमसाध्य है, और कुछ बैक्टीरिया विशिष्ट आत्महत्या प्लाज्मिड पैदा करने की आवश्यकता है. हालांकि मार्कर कम जीन विलोपन एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के संभव ध्रुवीय प्रभाव से बचने के लिए हो सकता है, पारंपरिक जीन मार्कर कम विलोपन विधि अधिक समय चोर हैSuming और मुश्किल आत्महत्या प्लाज्मिड विधि की तुलना में एक जीन निष्क्रिय. Escherichia कोलाई, जीनोम चौड़ा निशान कम जीन विलोपन एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन और तो प्रतिरोध कैसेट 6 के उन्मूलन के साथ प्रतिस्थापन के माध्यम से प्राप्त किया गया है. हालांकि, इस ई. कोलाई तनाव फेज λ लाल recombinase की आवश्यकता है. जीन विलोपन परिवर्तन से पहले, लाल सहायक प्लाज्मिड pKD46 ई. में शुरू किया जाना चाहिए 11 कोलाई. हमारी तकनीक में, हम जीन नष्ट कर दिया म्यूटेंट के विशाल बहुमत में APHA 3-प्रतिरोध जीन के प्रमोटर सफाया कर दिया और दो APHA-3 के समाप्त होता डिजाइन ओआरएफ जीन हटाए गए क्षेत्र के अभिव्यक्ति संरचना का पालन करें, ध्रुवीय से बचने के लिए प्रतिरोध कैसेट के प्रभाव मुद्दा. अब तक, हम कई इस तकनीक के द्वारा बनाई गई म्यूटेंट के समारोह का परीक्षण करने के बाद ध्रुवीय मुद्दा प्रभाव नहीं पाया है. आवश्यक जीनों के एक जीनोम चौड़ा और स्पष्ट सेट एस में अधिग्रहीत ध का प्रयोग sanguinis12 तकनीक भी प्रणाली में एंटीबायोटिक कैसेट के ध्रुवीय प्रभाव की कम संभावना मतलब. हम इरिथ्रोमाइसिन और chloramphenicol प्रतिरोध जीनों के रूप में अन्य प्रमोटर - कम एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों, इस तकनीक (नहीं दिखाया डेटा) में लागू किया जा सकता है प्रदर्शन किया है. इसके अलावा, इस तकनीक प्लाज्मिड आत्महत्या और खंगाला मेजबान जरूरत नहीं है. कुल मिलाकर, यह तकनीक उच्च throughput है जीनोम चौड़ा जीन विलोपन constructs बनाने और एक जीवाणु के जीनोम चौड़ा एक जीन उत्परिवर्तन में प्रदर्शन करने के लिए आसान हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम R01DE018138 स्वास्थ्य (PX) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान और भाग में समर्थित किया गया था, वर्जीनिया कॉमनवेल्थ विश्वविद्यालय राष्ट्रपति रिसर्च प्रोत्साहन कार्यक्रम (PRIP) 144602-3 (px). हम डीआरएस धन्यवाद. Lei चेन, Yuetan दोगुनी और जीनोम चौड़ा म्यूटेंट के निर्माण के साथ सहायता के लिए वैंग Xiaojing. हम भी वर्जीनिया कॉमनवेल्थ विश्वविद्यालय में डीएनए अनुक्रमण के लिए डीएनए कोर सुविधा धन्यवाद.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
Agarose | Promega | V3125 | |
BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
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