Les explants blastomères à l'essai pour l'engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Summary

Le destin d'une cellule individuelle embryonnaire peut être influencé par des molécules héréditaires et / ou par des signaux provenant des cellules voisines. L'utilisation de cartes sort de l'embryon de Xenopus clivage stade, blastomères simples peuvent être identifiés pour la culture en vase clos pour évaluer les contributions des molécules héritées par rapport interactions cellule-cellule.

Abstract

Cartes Destin, construits à partir de la lignée de traçage de toutes les cellules d'un embryon, qui révèlent les tissus descendent de chaque cellule de l'embryon. Bien que les cartes destin sont très utiles pour identifier les précurseurs d'un organe et pour élucider la voie de développement par lequel les cellules descendants peuplent cet organe dans l'embryon normal, ils n'illustrent pas le plein potentiel de développement d'une cellule précurseur ou d'identifier les mécanismes par lesquels son sort est déterminé. Pour tester la volonté du destin cellulaire, on compare répertoire normal d'une cellule de descendants dans l'embryon intact (la carte sort) avec ceux qui sont exprimés après une manipulation expérimentale. Est le destin de la cellule fixe (engagé), indépendamment de l'environnement cellulaire, ou est-elle influencée par des facteurs externes fournis par ses voisins? En utilisant les cartes complètes sort de l'embryon de Xenopus, nous décrivons comment identifier, d'isoler et de culture simples précurseurs stade de division, appelée blastomeres. Cette approche permet d'évaluer si ces premières cellules se sont engagés à le devenir qu'ils acquièrent dans leur environnement normal de l'embryon intact, nécessitent des interactions avec leurs cellules voisines, ou peut être influencée à exprimer destins alternatifs s'ils sont exposés à d'autres types de signaux.

Introduction

Xenopus laevis embryons ont été utilisés à grande échelle pour identifier les mécanismes par lesquels les cellules embryonnaires acquérir leurs destins particuliers parce que leurs œufs sont assez grands pour permettre des approches de microchirurgie. En outre, ils développent l'extérieur sans la nécessité d'une supplémentation nutritionnelle du milieu de culture, parce que chaque cellule contient une alimentation riche intracellulaire de plaquettes vitellines qui fournissent un accumulateur d'énergie intrinsèque. Un atout important pour l'étude des mécanismes par lesquels le destin des cellules est déterminée est l'ensemble complet de cartes sort des blastomères stade de division (à partir de 2 – à 32 cellules étapes) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Ces cartes ont été construits par micro-injection d'une molécule détectable en un seul blastomère identifiables et suivi plus tard dans le développement de tissus qui sont peuplées par les descendants étiquetés. Les cartes compatibles sont destin possible parce que les axes cardinaux des embryons peuvent être identifiés de façon fiable dans de nombreux embryos. Tout d'abord, dans tous les embryons de type sauvage de l'hémisphère animal est pigmenté, alors que l'hémisphère végétatif est pas. Deuxièmement, l'entrée des spermatozoïdes lors de la fécondation provoque une contraction de la pigmentation hémisphère animal vers le côté ventral avenir, dans de nombreux embryons une différence de pigmentation peuvent donc être utilisés pour discriminer entre les côtés dorsal et ventral. En troisième lieu, le premier sillon de clivage se rapproche du plan médian sagittal dans la plupart des embryons, et peut donc être utilisée pour identifier les bords droit et gauche de l'embryon. Les cartes sort aussi compter sur le fait que, naturellement, les oeufs fécondés fréquemment fendra par des motifs réguliers qui font que chaque blastomère identifiable à travers une large population d'embryons. Alors il existe une variabilité au sein et entre les couvées d'œufs sur des patrons de pigmentation et le décolleté, en utilisant les procédures de sélection décrite ici permet cellules avec des destins prescrites pour être identifié avec environ 90% de précision.

Destins cellulaires peuvent être dissuader lesextrait au cours de l'embryogenèse par plusieurs mécanismes. Les facteurs intrinsèques, tels que différemment héritées des ARNm cytoplasmiques ou des protéines, contribuent à plusieurs aspects de la structuration précoce. Par exemple, certains ARNm maternels déterminer les cellules qui contribuent à la lignée germinale, devenu l'endoderme, ou de contribuer à l'axe du corps dorsale (pour revue ^7). Les facteurs extrinsèques fournis localement par les cellules voisines ou plus lointainement à partir d'un centre embryonnaire de signalisation, sont responsables de l'induction types spécifiques de tissus et de motifs presque tous les systèmes d'organes. Exemples de centres de signalisation incluent l'organisateur / noeud dans la gastrula qui induit l'ectoderme neural et les modèles du mésoderme, et la zone d'activité polarisante que les modèles de l'axe antéro-postérieur du bourgeon de membre. Bien que les cartes destin d'identifier les précurseurs des différents organes et de révéler la voie du développement pris par leurs descendants dans l'embryon normal, ils ne peuvent pas distinguer intrinsèqueet les influences extrinsèques sur ces cellules. Ils ont également ne pas révéler le plein potentiel de développement d'une cellule, dont les descendants se différencier dans l'environnement complexe de signalisation de l'embryon. Deux approches expérimentales pouvez tester si le destin d'une cellule est déterminée par des facteurs intrinsèques ou est ensuite influencée par des facteurs externes: 1) la transplantation de la cellule à un emplacement roman dans l'embryon, ou 2) la suppression de la cellule de l'embryon suivie par la culture dans l'absence de signaux exogènes.

Les deux approches expérimentales ont été faisable chez Xenopus parce que les cellules sont assez grands pour être séparé manuellement. Par exemple, de nombreuses études ont supprimé des cellules individuelles à partir d'embryons (pour changer interactions cellule-cellule) ou des cellules transplantées à des endroits nouveaux dans les embryons d'accueil pour tester les modifications sort (commentaire en ^{7, 8, 9).} En outre, la seconde approche de l'explantation de petits nombres de cellules de différentes régions de l'embryon iculture nto d'élucider les interactions inductives tissulaires en l'absence de facteurs exogènes est possible parce que les cellules de l'embryon de Xenopus sont remplis d'un magasin intracellulaire des nutriments, les plaquettes vitellines. Par conséquent, elles peuvent être cultivées pendant quelques jours dans un milieu défini sans sel supplémentation nutritionnelle ou facteur de croissance du milieu de culture. Nous avons utilisé cette approche pour montrer que les blastomères animaux dorsales ont une capacité autonome pour produire des neurones et des tissus mésodermiques dorsales dues à hérité de la mère ARNm ^{10, 11,} et d'autres ont montré que la spécification du mésoderme de 32 cellules blastomères s'appuie à la fois sur l'information intrinsèque et extrinsèque ¹² . Un avantage de la culture de cellules comme explants, c'est que le milieu peut également être complétée par des facteurs de signalisation définis afin de déterminer quelle cellule-à-cellule voie de communication pourrait influer sur le sort de la cellule explanté ^{12, 13, 14.} En outre, on peut injecter le pr blastomèreIOR de culture avec de l'ARNm de surexprimer un gène, ou par des oligonucléotides anti-sens pour prévenir la traduction des ARNm endogènes. Ceux-ci, gain et perte de fonction des analyses permettent d'identifier les molécules sont nécessaires pour un destin autonome exprimé. Pour analyser le sort de l'explant, l'identification des types cellulaires spécifiques peuvent être effectuées par l'expression des gènes standard (par exemple, l'hybridation de situ, RT-PCR) et des tests immunocytochimiques. Ce protocole fournit un moyen simple, mais puissant, moyen de distinguer entre les mécanismes intrinsèques et extrinsèques qui régissent la façon dont une cellule embryonnaire se développe dans des tissus spécifiques.

Protocol

1. Préparation des instruments, de la Culture et des Médias Plats Aiguisez quatre pinces à l'aide de film abrasif d'alumine. Pour ce faire, sous un microscope à dissection pour contrôler la taille de la pointe. Une paire de pince sert de back-up au cas où un embout est endommagé lors de la procédure. Autoclaver les quatre pinces et conserver dans un contenant stérile. Assurez 500 ml de milieu de culture 0,1 X 1,0 X et (que ce soit Sonneries Marc jour [MMR] ou modification de Barth S…

Representative Results

La capacité de ce test pour évaluer précisément le potentiel de développement de la cellule repose sur la dissection sur le blastomère correcte basée sur le sort des cartes 1, 2, 3, 4, 5, 6. Par conséquent, il est essentiel de choisir des embryons avec le motif de la pigmentation correcte au stade 2-cellules, comme illustré à la figure 1, qui par la suite se conformer aux habitudes régulières de clivage, comme l'illustre la figure 2. Si l'on observe les em…

Discussion

Les étapes les plus importantes pour la culture réussie des blastomères individuels sont les suivants: 1) identifier correctement le blastomère d'intérêts; 2) le maintien d'un stérile, culture saine; 3) les cellules de dissection à la partie appropriée du cycle cellulaire, et 4) l'élaboration du manuel nécessaire dextérité pour éviter des dommages lors de la dissection et de transférer à la culture bien.

Pour manipuler blastomères spécifiques, il est essentiel d…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use