Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

Summary

גורלו של תא עוברי אדם יכול להיות מושפע על ידי מולקולות ירושה ו / או על ידי אותות מתאים שכנים. ניצול מפות גורלו של עובר Xenopus שלב המחשוף, לסטומרים בודדים ניתן לזהות לתרבות בבידוד כדי להעריך את התרומה של מולקולות ירושה לעומת אינטראקציות תא סלולרי.

Abstract

מפות גורל, שנבנו משושלת התחקות כל התאים של עובר, לחשוף אילו רקמות לרדת מכל תא של העובר. למרות שמפות גורל הן מאוד שימושיות לזיהוי המקדים של איבר והבהרת נתיב התפתחות שבאמצעותו את תאי הצאצא לאכלס איבר שבעובר הנורמלי, הם לא להמחיש את הפוטנציאל ההתפתחותי המלא של תא מבשר או לזהות את המנגנונים שבאמצעותם גורלו נקבע. כדי לבדוק את מחויבות גורל תא, אחד משווה רפרטואר הרגיל של תא של צאצאים בעובר ללא פגע (מפת הגורל) עם אלה הביעו אחרי מניפולציה ניסויית. האם גורלו של התא קבוע (מחויב) ללא תלות בסביבה התאית שמסביב, או שהוא השפיע עליו על ידי גורמים חיצוניים הניתנים על ידי שכנותיה? שימוש במפות הגורל המקיפות של עובר Xenopus, אנו מתארים כיצד לזהות, לבודד ומבשרי שלב ביקוע בודד תרבות, הנקרא blastoשכירי חרב. גישה זו מאפשרת לאדם להעריך אם התאים האלה מוקדם מחויבים לגורל שהם רוכשים בסביבת הרגילה שלהם בעובר ללא פגע, דורשים אינטראקציות עם תאי שכניהם, או יכולים להיות מושפע להביע גורלות חלופיים אם נחשפו לסוגים אחרים של אותות.

Introduction

עוברי Xenopus laevis כבר נוצל בהרחבה כדי לזהות את המנגנונים שבאמצעותם תאים עובריים לרכוש הגורלות הספציפיים שלהם, כי הביצים שלהם הן ​​גדולות מספיק כדי לאפשר גישות מייקרו. בנוסף, הם מפתחים חיצוניים ללא צורך בתוספים תזונתיים של מדיום התרבות, מכיוון שכל תא מכיל תאי היצע עשיר של טסיות חלמון המספקות חנות אנרגיה פנימית. נכס חשוב ללימוד המנגנונים שבאמצעותם גורל תא נקבע הוא הסדרה המקיפה של מפות גורל לסטומרים שלב הביקוע (מגיל 2 – באמצעות שלבים 32-תא) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} מפות אלה נבנו על ידי microinjecting מולקולת זיהוי לblastomere אחד מזוהה וניטור בהמשך פיתוח רקמות אשר מאוכלסות על ידי הצאצאים שהכותרת. מפות גורל עקביות הן אפשריות, כי צירי היסוד של העוברים ניתן לזהות באופן אמין באמברי רבמערכת הפעלה. ראשית, בכל עוברי סוג בר אונת החיה היא פיגמנט, ואילו בחצי הכדור הצמחי הוא לא. שנית, כניסתו של הזרע בהפריה גורמת להתכווצות של פיגמנטציה אונת הבהמה לצד הגחוני העתיד; בעוברים רבים הבדל פיגמנטציה ולכן ניתן להשתמש בו כדי להיפלות בין צדדי גב וגחון. שלישית, מחשוף התלם הראשון הקרוב למטוס באמצע sagittal ברוב העוברים, ולכן ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הצדדים הימניים ושמאליים של העובר. מפות הגורל מסתמכות גם על העובדה שלעתים קרובות ביצים מופרות באופן טבעי לדבוק בדפוסים קבועים שהופכים כל blastomere זיהוי פני אוכלוסייה גדולה של עוברים. אמנם יש שונות בתוך ובין ציפורניה של ביצים לגבי דפוסי פיגמנטציה ומחשוף, תוך שימוש בהליכי בחירה מתוארת כאן מאפשר לתאים עם גורל שנקבע להיות מזוהים עם כ 90% דיוק.

גורל תא ניתן להרתיעממוקש במהלך התפתחות עוברת במספר מנגנונים שונים. גורמים פנימיים, כגון mRNAs או חלבוני cytoplasmic ירושה באופן דיפרנציאלי, לתרום למספר היבטים של דפוסים מוקדמים. לדוגמה, mRNAs האימהי הספציפי לקבוע אילו תאים יתרמו לשורת הניבט, הפכו האנדודרם, או לתרום לציר הגוף הגבה (סקר ^ב7). גורמים חיצוניים הניתנים באופן מקומי על ידי תאים סמוכים או יותר מרחק ממרכז איתות עוברית, אחראים לגרימת סוגים ספציפיים של רקמות ודפוסים כמעט בכל מערכת איברים. דוגמאות למרכזי איתות כוללות מארגן / הצומת בgastrula שגורם לאקטודרם ודפוסים העצביים מזודרם, והאזור של קיטוב פעילות שדפוסי הציר קדמי-האחורי של ניצן הגפה. למרות שמפות גורל לזהות את הסימנים המקדימים של איברים השונים ולחשוף את נתיב התפתחות נלקח על ידי צאצאיהם בעובר הנורמלי, הם לא יכולים להבחין בין מהותייםוהשפעות חיצוניות על תאים אלה. הם גם לא לחשוף את הפוטנציאל ההתפתחותי המלא של תא, שצאצאיו להבחין בסביבה המורכבת האיתות של העובר. שתי גישות ניסיוניות יכולות לבדוק אם גורלו של תא נקבע על ידי גורמים פנימיים או בהמשך מושפע מגורמים חיצוניים: 1) השתלה של התאים למיקום רומן בעובר, או 2) הסרת התא מהעובר ואחרי התרבות ב היעדר אותות חיצוניים.

שתי הגישות הניסיוניות שהיו אפשריות בXenopus כי התאים הם גדולים מספיק כדי להיות מופרד באופן ידני. לדוגמה, מחקרים רבים שמחקו תאים בודדים מעוברים (לשנות אינטראקציות תא סלולרי) או תאים מושתלים למיקומים חדשים בעוברים מארחים לבדיקת שינויי גורל (שנסקרו ^{ב7, 8, 9).} בנוסף, הגישה השנייה של explanting מספר קטן של תאים מאזורים שונים של העובר אניתרבות n כדי להבהיר אינטראקציות רקמות אינדוקטיביים בהיעדר גורמים אקסוגניים אפשרית, כי תאיו של עובר Xenopus מלאות בחנות תזונתית תאית, טסיות החלמון. לכן, הם יכולים להיות מתורבתים לכמה ימים במלח בינוני מוגדר ללא תוספת גורם תזונתית או צמיחה של מדיום התרבות. יש לנו להשתמש בגישה זו כדי להראות כי בעלי חי לסטומרים גב יש יכולת אוטונומית לייצר רקמות עצביות והגבו mesodermal בשל mRNAs ירש אימהי ^{10, 11,} ואחרים הראו שהמפרט של מזודרם לסטומרים 32-סלולריים מסתמך על שניהם מידע פנימי וחיצוני ¹² . יתרון של תאי culturing כexplants הוא שהמדיום יכול גם להשלימו עם גורמים המוגדרים איתות כדי לקבוע אילו תא לתא מסלול תקשורת עלולה להשפיע על גורלו של תא explanted ^{12, 13, 14.} בנוסף, ניתן להזריק blastomere יחסי הציבורIOR לתרבות עם mRNA ליותר מ-Express גן, או עם oligonucleotides אנטי תחושה למנוע התרגום של mRNAs אנדוגניים. ניתוחים אלה, רווח והפסד, של הפונקציה יכולים לזהות אילו מולקולות נדרשות לגורל מתבטא בצורה אוטונומית. כדי לנתח את גורל explant, זיהוי של סוגי תאים מסוימים יכול להתבצע על ידי ביטוי גנטי סטנדרטי (למשל, כלאה באתר, RT-PCR) ומבחני immunocytochemical. פרוטוקול זה מספק, בדרך פשוטה, אך רבת עצמה כדי להבחין בין מנגנונים פנימיים וחיצוניים שקובעים איך תא עוברי מתפתח לרקמות ספציפיות.

Protocol

1. הכנת מכשירים, מדיה תרבות ומנות חידוד 4 מלקחיים באמצעות סרט שוחק אלומינה. האם זה תחת מיקרוסקופ לנתח לפקח גודל הטיפ. זוג אחד של מלקחיים משמש כגיבוי במקרה קצה הניזוק במהלך ההליך. חיטוי כל ארבעת המלקחיים ולאחסן במכל סטרי?…

Representative Results

היכולת של assay זה במדויק על מנת להעריך את הפוטנציאל ההתפתחותי של התא מסתמכת על לחתוך רקמות blastomere הנכון מבוססות על הגורל 1 מפות, 2, 3, 4, 5, 6. לכן, חשוב לבחור עוברים עם דפוס פיגמנטציה הנכונה בשלב 2-התא, כפי שמודגם באיור 1, שלאחר מכן להתאים לדפוסי ביקוע רגילים, כפי…

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר עבור culturing המוצלח של לסטומרים בודדים הם: 1) כשזיהו את blastomere עניין: 2) שמירה על תרבות סטרילי, בריאה, 3) תאים המפרקים בחלק הנכון של מחזור התא; ו4) פיתוח המדריך לצורך זריזות כדי למנוע הניזק במהלך נתיחה ולהעביר לתרבות טובה.

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direc…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use