הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה
Summary
אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.
Abstract
הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא שיטה בשימוש נרחב לקביעת יחסי הגומלין של חלבונים שונים עם ה-DNA בכרומטין של תאי חיים. דוגמאות לכך כוללות רצף ספציפי DNA מחייבים שעתוק גורמים, ההיסטונים ומצבי השינוי השונים שלהם, אנזימים כגון polymerases RNA וגורמים נלווים, ורכיבי תיקון DNA. למרות שכיחותה, קיים מחסור של up-to-תאריך, מתודולוגיות מפורטות להכנה גם הספסל של חומר ולניתוח מדויק המאפשר למדדי כמותיים של אינטראקציה. בשל חוסר זה של מידע, וגם כי, כמו כל immunoprecipitation, תנאים חייבים להיות מחדש מותאם לקבוצות חדשות של תנאי ניסוי, assay השבב הוא רגיש לתוצאות לא מדויקות או גרוע כמותי.
הפרוטוקול שלנו נגזר מסופו של דבר עבודת זרע בגורם שעתוק: אינטראקציות DNA 1,2, אך משלב מספר השיפורים לsensitivity ושחזור לסוגי תאים קשים להשגת. הפרוטוקול שימש בהצלחה 3,4, שניהם באמצעות qPCR לכמת העשרת דנ"א, או באמצעות גרסה חצי כמותית של להלן הפרוטוקול.
ניתוח כמו זה של חומר PCR-מוגבר מתבצע המחשוב, ומהווה גורם מגביל בassay. בקרות חשובות ושיקולים אחרים כוללים שימוש בנוגדן אלוטיפ בהתאמה, כמו גם הערכה של אזור שליטה של הדנ"א הגנומי, כגון אזור גניים חזה לא להיות מחויבים לחלבון הנחקר (או צפוי שלא להציג שינויים תחת תנאי הניסוי). בנוסף, עקומת תקן של חומר הזנה לכל שבב היא מדגם המשמשת לחישוב רמות מוחלטות של העשרה בחומר הניסיוני. שימוש בעקומות סטנדרטיות עוזרת לקחת בחשבון את ההבדלים בין ערכות פריימר, לא משנה כמה הם נועדו בזהירות, וגם יעילות שונהences ברחבי הטווח של ריכוזי תבנית עבור קבוצת פריימר יחידה. הפרוטוקול שלנו הוא שונה מאחר, כי הם זמינים 5-8 שבהרחבת כיסוי השלב מאוחר יותר, הניתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול לעיל מספק שיטה חזקה של כימות מדויק העשרת DNA מלימפוציטים ראשוניים באמצעות שבב. אחת סיבות העיקריות לחוסנו בפרוטוקול זה היא ההכללה של משכפל ביולוגי. הפרוטוקול לעיל משתמש בשלוש חזרות, להעשרה אשר מחושבת באופן עצמאי. את היציאות לאחר מכן בממוצע כדי לספק מידה מ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי CA141009 וGM39067. אנו מודים א 'ור' פארנל Yarrington להערות על החלק הכתוב.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | Store at RT |
| Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30256.01 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 04693116001 | Store at 4 °C |
| Protein G magnetic beads | Active Motif | 101945 | Store at 4 °C |
| RNase A (20 mg/ml) | EMD Millipore | 556746 | Store at -20 °C |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Roche | 03115879001 | Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0 |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-034 | Store at -20 °C |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | Store at -20 °C |
| 1 M Glycine | Store at RT | ||
| Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) | Store at 4 °C | ||
| Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) | Store at RT | ||
| ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) | Store at 4 °C | ||
| TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) | Store at 4 °C | ||
| Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) | Prepare fresh | ||
| 5 M NaCl | Store at RT | ||
| 0.5 M EDTA | Store at RT | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.5 | Store at RT | ||
| Table of Specific Reagents | |||
| Clay Adams Brand Nutator | Becton Dickinson | Model: 421105 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5342 | |
| Qiaquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Masonix Sonicator 3000 | QSonica | Model: S3000 | |
| UV Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
| Heating Block | VWR | 13259-030 | |
| Rotator | VWR | 80085-692 | |
| Refrigerated bench top centrifuge | Beckman Coulter | Model: Allegra X-12R | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Table of Equipment |
Referências
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 37-47 (2002).
- Li, Q., et al. Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity. J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).
- Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states. The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).
- Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. Genome-wide localization of replication factors. Methods. 57, 187-195 (2012).
- O’Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).
- Sikes, M. L., et al. A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation. Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4, 651-657 (2007).
