Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

Summary

Nós descrevemos um método robusto para cromatina imunoprecipitação utilizando células T primárias. O método baseia-se em métodos normais, mas utiliza um conjunto específico de condições e reagentes que melhoram a eficiência de uma quantidade limitada de células. Importante, é apresentada uma descrição detalhada da fase de análise de dados.

Abstract

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) é um método amplamente utilizado para determinar as interações entre diferentes proteínas com o DNA na cromatina de células vivas. Exemplos incluem sequências específicas de DNA de ligação fatores de transcrição, histonas e seus diferentes estados de modificação, enzimas como RNA polimerases e fatores auxiliares e componentes de reparação do ADN. Apesar de sua onipresença, há uma falta de up-to-date, metodologias detalhadas para ambos banco preparação do material e para a análise precisa permitindo métricas quantitativas de interação. Devido a esta falta de informação, e também porque, como qualquer imunoprecipitação, as condições devem ser re-otimizado para novos conjuntos de condições experimentais, o ensaio chip é suscetível a resultados imprecisos ou mal quantitativa.

Nosso protocolo é em última análise, derivada do trabalho seminal no fator de transcrição: interações DNA ^1,2, mas incorpora uma série de melhorias para sensibilizantesvidade e reprodutibilidade para os tipos de células de difícil obtenção. O protocolo foi utilizado com sucesso ^3,4, ambos utilizando qPCR para quantificar o enriquecimento do ADN, ou uma variante usando semi-quantitativa do protocolo abaixo.

Esta análise quantitativa de material amplificado por PCR é realizada computacionalmente, e representa um factor limitante no ensaio. Controlos e outras considerações importantes incluem a utilização de um isotipo do anticorpo, bem como a avaliação de uma região do ADN genómico de controlo, tal como uma região intergénica não predito para ser ligado pela proteína sob estudo (ou antecipados não apresentam alterações ao abrigo as condições experimentais). Além disso, uma curva padrão de material de entrada para cada amostra de chip é usada para determinar os níveis absolutos de enriquecimento do material experimental. Uso de curvas padrão ajuda a levar em conta as diferenças entre conjuntos de primers, independentemente de como eles são projetados com cuidado, e também a eficiência diferemcias em toda a gama de concentrações de modelo para um único conjunto de primers. Nosso protocolo é diferente de outros que estão disponíveis ^5-8 em que extensivamente cobrir a, fase posterior análise.

Protocol

1. Isolamento de mouse Esplenopatias Naïve células T CD4 Sacrificar o mouse em uma forma humana consistente com o uso do Comité (IACUC) protocolos institucionais Cuidados e Animal. Dissecar o baço e colocá-lo em uma placa de Petri contendo 10 ml de DMEM com 10% de FBS. Esmagar o baço usando fosco extremidades de duas lâminas de vidro para liberar os esplenócitos. Transferência da suspensão de células num tubo cónico de 15 ml. Recolher as células por centrifugação a 200 xg (~…

Representative Results

A cromatina imunoprecipitação (CHIP) protocolo apresentado aqui controles para as diferenças, se houver, na quantidade de DNA utilizado na PCR através da utilização de um par de primers que amplifica uma região do genoma não ligado, servindo, assim, como um "controle de carga". No exemplo mostrado na Figura 3, utilizou-se a região de codificação do gene de rato ACTB como uma região não acoplada para a proteína de interesse e o local de ligação ao factor de transcriçã…

Discussion

O protocolo acima fornece um método robusto de quantificar com precisão o enriquecimento do ADN a partir dos linfócitos primários usando chip. Uma das principais razões para a robustez deste protocolo é a inclusão da diversidade biológica repetições. O protocolo acima usa três repetições, o enriquecimento para os quais é calculado de forma independente. As saídas são então calculadas para fornecer um grau de enriquecimento e desvios padrão calculados para proporcionar uma medida de variabilidade. Para …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
			Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
			Table of Equipment