Summary
يوصف بروتوكول رواية لإعداد الميكانيكية من الايقاف الخلية الخصية من المواد القوارض، وتجنب الانزيمات والمنظفات و. طريقة بسيطة جدا وسريعة، واستنساخه، ويجعل جيدة الايقاف الخلية الجودة، والتي هي مناسبة لتدفق الفرز واستخراج الحمض النووي الريبي.
Abstract
الخصيتين الثدييات هي الأجهزة المعقدة جدا التي تحتوي على أكثر من 30 أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجسدية الخصية ومراحل مختلفة من الخلايا الجرثومية. هذا التباين هو العيب هامة تتعلق بدراسة أسس تكوين الحيوانات المنوية لدى الثدييات، كما هناك حاجة السكان الخلية نقية أو المخصب في مراحل معينة من تطور الحيوانات المنوية لمعظم التحليلات الجزيئية 1.
استراتيجيات مختلفة مثل Staput 2،3، تصويل الطرد المركزي 1، والتدفق الخلوي (FC) 4،5 وقد استخدمت للحصول على السكان الخلية الخصية المخصب أو تنقيته من أجل تمكين دراسات التعبير الجيني التفاضلي.
هو مطلوب منها أن الخلايا هي في تعليق لمعظم النهج تخصيب / تنقية. من الناحية المثالية، فإن تعليق خلية تكون ممثلة من النسيج الأصلي، لديها نسبة عالية من خلايا قابلة للحياة وقليلة multinucleates - التي تميل إلى تشكيل لللطبيعة المخلوي من ظهارة المنوية 6،7 - وعدم وجود كتل الخلية 1. وكانت تقارير سابقة يتضح أن الايقاف الخلية الخصية باستخدام أسلوب الميكانيكية حصريا على استعداد تجمعت أكثر سهولة من تلك trypsinized 1. من ناحية أخرى، والعلاجات الأنزيمية مع RNAses و / أو الأنزيمات تفصيل مثل التربسين وكولاجيناز تؤدي إلى تدهور الجزيئات محددة، وهو غير مرغوب فيه لبعض التطبيقات المصب. وينبغي أن تكون عملية مثالية قصيرة قدر الإمكان وتتطلب الحد الأدنى من التلاعب، وذلك لتحقيق الحفاظ جيدة من الجزيئات ذات الأهمية مثل mRNAs و. البروتوكولات الحالية لإعداد تعليق خلية من الأنسجة الصلبة وعادة ما تكون تعتمد على المشغل تستغرق وقتا طويلا، إلى حد كبير، وربما تلف انتقائي بعض أنواع الخلايا 1،8.
بروتوكول المعروضة هنا يجمع بين مزايا تصنيفها الميكانيكية استنساخه للغاية وجيزة للغاية مع أحدbsence العلاج الأنزيمية، مما أدى إلى تعليق خلية جيدة الجودة التي يمكن استخدامها لتحليل تدفق cytometric والفرز 4، ودراسات التعبير الجيني خفية 9.
Protocol
1. إعداد تعليق خلية
- تضحية العينة ليتم استخدامها بعد توصيات اللجان المتخصصة مثل IACUC أو ما يعادلها (في أوروغواي، اللجنة الوطنية للتجارب على الحيوانات [مناخ الأعمال]). في حالتنا، وتدار جرعة زائدة من بنتوباربيتال.
- تشريح الخصيتين وفقا للإجراءات القياسية المعتمدة ووضعها في 96 مم الزجاج طبق بتري على الجليد، التي تحتوي على 10 مل من الجليد الباردة DMEM تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين.
- إزالة الغلالة البيضاء وقطع الخصيتين الأرتيميا Decapsulated إلى قطع مربعة من 2-3 ملم على كل جانب.
- ثم تتم معالجة تلك القطع في Medimachine، وهي طاحونة ميكانيكية الآلي حيث يتم تفصيل هذه الأنسجة داخل وحدة التخلص منها تحتوي على شاشة الفولاذ المقاوم للصدأ مثقبة والدوار المعادن. للقيام بذلك، ضع 1 مل من البرد تستكمل DMEM و4-5 من هذه القطع في 50 ميكرون وحدة القابل للتصرف، والتبديل على disaggregator، وعملية لمدة 50 ثانية بعد تعليمات بسيطة من الشركة المصنعة.
- استرداد تعليق الخلية الناتجة من وحدة التفكيك باستخدام 3-5 مل حقنة من دون إبرة.
- تحديد من خلال 50 ميكرومتر شبكة النايلون، غارقة في السابق مع 0.5 مل تستكمل DMEM.
- تعليق تصفية مرة أخرى باستخدام غارقة 25 ميكرومتر شبكة النايلون، ومكان على الجليد.
- عد في غرفة نويباور وضبط تركيز الخلوية إلى 1 - 2 × 10 7 خلية / مل مع DMEM تستكمل. لا يقل عن 4 × 10 وعادة ما يتم الحصول عليها 7 خلية / جرام من المواد الخصية.
- أخيرا، إضافة التجمع الوطني الديمقراطي (2 نفثول-6 ،8-دسلفنك حامض، ملح ثنائية البوتاسيوم) إلى تركيز النهائي من 0.2٪ من أجل منع تكتل الخلية.
- اختياري: تحقق بقاء الخلية من الايقاف الخلية الخصية مع مجموعة الجدوى المتاحة تجاريا لخلايا الحيوان، باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
2. تدفق تحليل Cytometric
ve_content "> وقد استخدمنا تدفق FACSVantage بيكتون ديكنسون عداد الكريات مجهزة متماسكة الأرجون ليزر ايون ضبطها لتنبعث منها في 488 نانومتر لتحليل الخلايا الملون مع تركيزات عالية من يوديد propidium (PI). (القضية من مدخل PI في غير المثبتة وقد عولجت الخلايا تحت الضغط في مكان آخر 9،10).- لتلطيخ PI، إضافة تألقي في تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل لتعليق الخلية، واحتضان لمدة 10 دقيقة في 0 درجة مئوية في الظلام.
- تم تعيين قوة الليزر إلى 100 ميغاواط، ويستخدم مرشح تمرير 575/26 النطاق لجمع PI-تنبعث مضان في FL2.
- ونحن أداء قياسات FC مع فوهة ميكرون 70. لفرز السكان منوية، تعيين وضع الفرز في نورمال-R أو عادي-C، وذلك باستخدام 3 قطرات الفرز كما المغلف. الحفاظ على عينة وأنابيب جمع في 3 - 4 ° C باستخدام وحدة التبريد. ضبط الفرق عينة لتحليل الخلايا بمعدل 500 إلى 1،500 في الثانية الواحدة.
- استخدام البرمجيات CellQuest (BD) لتحليلالمعلمات التالية: مبعثر إلى الأمام (FSC-H)؛ الجانب مبعثر (SSC-H)؛ مجموع مضان المنبعثة أو منطقة النبض (FL2-A)، ومدة الانبعاثات مضان أو نبض العرض (FL2-W).
بدلا من ذلك، ونحن قد استخدمت حيوي صبغ هويشت 33342 إلى تركيز النهائي من 5 ميكروغرام / مل والمحتضنة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. تم إجراء تحليل الخلية عن طريق عداد الكريات MoFlo (DakoCytomation) مجهزة الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية الإثارة ليزر يعمل بطاقة 25 ميغاواط وذلك باستخدام فوهة ميكرون 70. تم إجراء معالجة البيانات مع القمة V4.3 البرمجيات (DakoCytomation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد مثال على تعليق خلية مفصلة جيدا من الخصيتين الفئران أعدت مع بروتوكول الموصوفة هنا في الشكل 1.
بالمقارنة مع العلاجات الأنزيمية 6،8 وطرق تصنيفها الميكانيكية التي سبق وصفها 2، واحد المقدمة هنا هو أسرع بكثير وينطوي على أقل المناولة، وغير قابلة للتكرار بسهولة (لا تعتمد على المشغل)، ويجعل الحطام الخلية النادرة (وخصوصا بالمقارنة مع غيرها الميكانيكية الأساليب) وعدد قليل جدا من multinucleates (التي وصفت لتشكيل نتيجة للتلاعب الأنسجة واسعة 1،2). وعلاوة على ذلك، على عكس العلاجات الأنزيمية، فإنه يتجنب استخدام RNAses، التربسين وكولاجيناز، يمكن أن تشجع الجزيئات تدهور.
من ناحية أخرى، على الرغم من أن تقارير سابقة قد يدل على أن الايقاف الخلية الخصية باستخدام أسلوب الميكانيكية حصريا على استعداد تجمعت بسهولة أكثر من trypsinized علىES 1، وتطبيق هذا الأسلوب المقدمة التثاقل القليل جدا في المعلقات الخلوية، كما يمكن أن يرى في الشكل 1. وبهذا المعنى، فقد وجدنا إدراج التجمع الوطني الديمقراطي فعالة جدا في منع تكتل الخلية، وتجنب انسداد فوهة خلال دراسات تدفق اللاحقة. الشكل 1 أيضا يكشف عن ندرة الحطام الخلية، والتي هي أيضا واضحة في رسوم بيانية FC مبين في الشكل 2.
الى جانب ذلك، الايقاف الخلية أعدت مع هذا الأسلوب تظهر التمثيل الكافي من أنواع مختلفة خلية الخصية. وقد اختتمت هذه بمقارنة التركيبة الخلوية من الايقاف الخلية الخصية بواسطة الطريقة المعروضة هنا مع البيانات الواردة من عدد الخلايا في المقاطع العرضية من الأنابيب المنوية إعدادها، ومع الايقاف الخلية أعدت باستخدام طرق أخرى كذلك (الجدول 1).
FC رسوم بيانية تم الحصول عليها لتعليق من قبل بريسي أعدتبروتوكول NT وملطخة إما مع هويشت 33342 (الشكل 2A) أو PI (الشكل 2B) لا تختلف كثيرا عن تلك التي ذكرت سابقا 8، ودعم أيضا افتراض أن الإجراء لا يضر انتقائي أي نوع من الخلايا المحددة.
| أنواع الخلايا الخصية يعتمد على محتوى الحمض النووي | الخصية سليمة و(٪) | تعليق المعدة ب (٪) - Medimachine | تعليق Trypsinized A (٪) |
| A) المصحف العضلة | |||
| C | 66.2 | 62.5 | 79.6 |
| 2C | 16.4 | 18.4 | 7.3 |
| 4C </ TD> | 17.9 | 18.7 | 8.7 |
| آخرون | - | - | 4.6 |
| B) خنزير غينيا porcellus | |||
| C | 66.5 | 65.5 | N / D |
| 2C | 11.0 | 11.5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23.0 | N / D |
| وجرى تقييم لعدد الخلايا عن طريق الملاحظة مجهري. قيمت ب عدد الخلايا التي التدفق الخلوي. | |||
الجدول 1. النسب المئوية النسبية من الكبار السكان الخلية الخصية واختلاف في محتوى الحمض النووي من أجل تعليق خلية من الماوس (A) وخنزير غينيا (B) من خلال الطريقة المعروضة هنا أعدت، مقارنة الخصية سليمة و- للماوس - T س الايقاف التربسين مصنوعة (تم التعديل من Geisinger ورودريغيز Casuriaga، Cytogenet. الدقة الجينوم. 128، 46 (2010)). محتويات DNA هي: C (طلائع منوية المستديرة والتمطيط، الحيوانات المنوية)، 2C (الخلايا الجسمية الخصية، أمهات المني، الخلايا المنوية الثانوية)، و4C (الخلايا المنوية الأولية وأمهات المني المتكاثرة القليلة في مرحلة G2).
الشكل 1. نظرة جزئية من تعليق خلية من خصية الفئران الكبار عليه في هذا البروتوكول إعداد وتصور بواسطة المجهر مرحلة التباين. كما يمكن أن يرى، يتم الحفاظ عليها جيدا cytoplasms الخلية. يتوافق شريط إلى 25 ميكرون. مستنسخة من رودريغيز Casuriaga، وآخرون، بيول. Proced. على الانترنت. 11، 184 (2009).
-together.within الصفحات = "دائما"> 
الشكل 2. FC DNA تحليل المحتوى من الايقاف الخلية الخصية من الجرذان الكبار، والفئران والخنازير الغينية، ومن 21 يوما بعد الولادة (DPP) الفئران الوليدة، ملطخة حيوي صبغ هويشت 33342 (A) أو مع PI (B). وفي جميع الحالات السكان الخلية C، 2C و 4C يمكن الكشف عنها بسهولة في رسوم بيانية تم الحصول عليها مع كل من الأصباغ، فضلا عن ذروة ما يبدو شبه فرداني إلى اليسار من السكان C. وقد تجلى هذا الأخير الذروة لاحتواء الحيوانات المنوية، والتي تبدو وكأنها، حيوانية أقل الملون منفصلة نظرا لدولتهم لونين مكثف 12. لاحظ ندرة من الحطام في كل الرسومات. هذا واضح بشكل خاص في الحزب الديمقراطي التقدمي 21 (عينات الأحداث) لمحات، التي تفتقر إلى طلائع منوية والحيوانات المنوية. تم التعديل من Geisinger ورودريغيز Casuriaga، Cytogenet. بحوث الجينوم. 128، 46 (2010). انقر هنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل (3). فرز السكان الخلية 4C من تعليق خلية الخصية من الفئران الكبار. الخلايا مصنفة ترسبت على الشرائح L المعالجة بولي يسين نظيفة، ولاحظ تحت المجهر على النقيض من المرحلة (A) أو حقل مشرق بعد تلطيخ بالغيمزا (B). بار = 20 ميكرون. مستنسخة من Geisinger ورودريغيز Casuriaga، Cytogenet. بحوث الجينوم. 128، 46 (2010).
tp_upload/50102/50102fig4highres.jpg "/>
الشكل 4 أ) FC تحليل لخنزير غينيا الكبار تعليق خلية الخصية أعدت مع بروتوكول الموصوفة هنا (أ)، الرسم البياني؛ (ب)، مؤامرة نقطة. ملاحظة مجموعات سكانية فرعية اثنين في السكان الخلية 4C. ب) تحليل فرز الخلايا من R3 4C (أ، ب) و R4 (أ '، ب') مناطق (أ، A ')، صور المجهر Epifluorescence من الخلايا PI الملطخة . لاحظ أنه نوى من المنطقة R3 هي أصغر نسبيا. شريط: 10 ميكرومتر (B، B ')، ليزر متحد البؤر المجهري من ردود الفعل immunocytochemical على خلايا انتشار استخدام أجسام مضادة ضد Sycp3 (المشبكي الخيطي معقدة [SC] بروتين 3، وهو مكون عنصر الوحشي). يسمح للصورة استنتاج مفاده أن جزء R3 يتوافق مع (lepto / دور الاقتبال) meiocytes في وقت مبكر، والتي يمكن أن ينظر محاور بسيطة وقصيرة تمتد من SCS، في حين R4 يحتوي meiocytes طور التثخن، مع COMتجميعها pletely المنبوذة. تم التعديل من رودريغيز Casuriaga، وآخرون، الخلوي A 79، 625 (2011). انقر هنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل 5. أعدت A) agarose هلام الكهربائي من مجموع الرنا المستخرج من المنوية تدفق تصنيف الكسور خلية 2C، R3 R4 و(شرح على اثنين من الكسور الأخير هو في الشكل 4). الايقاف الخلية مع بروتوكول الموصوفة هنا. B) صورة الإشعاع الذاتي لتغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد الكهربائي يظهر الفرق العصابات [كدنا] التي تم الحصول عليها عن طريق "عرض الفرق مرنا" طريقة (RNAimage؛ شركة GenHunter، ناشفيل، TN) عن واحدة من مجموعات التمهيدي من المجموعة. mRNAs وثلاثة من نفس السكان الخلية كما هو الحال في
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأسلوب الأمثل هو موضح هنا يمكن إعداد تعليق خلية من القوارض أنسجة الخصية بطريقة سريعة جدا وقابلة للتكرار، وتجنب انزيم المنظفات والعلاج والمحافظة على سلامة الخلية جيد ونوع النسب. الاختصار في الإجراء (تشمل 15 دقيقة تمتد تشريح الخصية، وقطع الأنسجة، والتصنيع)، والحد الأدنى التعامل مع الجهات المعنية، وغياب العلاجات الأنزيمية هي بعض من المزايا الرئيسية. كل هذه ستمثل المحافظة جيدة من الجزيئات الحياة قصيرة، وهو أمر حاسم عندما يكون مطلوبا عينة تمثيلية من مركبات موجودة في السكان الخلية الأصلية.
وفيما يتعلق باستخدام إما PI أو هويشت 33342، لاحظنا عدم وجود فروق واضحة في ملامح الناتجة عن تحليل تدفق cytometric من الايقاف الخلية الخصية مع توظيف واحد أو الصبغة الأخرى. فإن اختيار صبغ تعتمد بدلا من ذلك على تفضيلات المستخدم والتوفر، وعلى مزيد من الاستخدام المخطط. على جانب واحد، PI هو أرخص، والتطبيق على نطاق واسع كما لا تتطلب استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي وفارزات وجود ليزر الأشعة فوق البنفسجية. من جهة أخرى، على الرغم من أننا قد استخدمت بنجاح الخلايا PI الملطخة للفرز خفية والتفضيلية دراسات التعبير الجيني (الشكل 4)، هويشت 33342 أو صبغة حيوية أخرى مع مستويات منخفضة السمية الخلوية يمكن أن تكون الخيارات الأفضل للتطبيقات التي تتطلب بقاء الخلية بالكامل، مثل زراعة الخلايا الجرثومية و / أو زرع 4.
لقد كنا قادرين على فرز السكان خلية معينة تحقيق أكثر من 95٪ نقاء إما للسكان الخصية المحددة مع محتوى الحمض النووي مختلفة 4 (الشكل 3)، أو حتى لمجموعات سكانية فرعية مع محتوى الحمض النووي نفسه ولكنها مختلفة المستويات التكثيف لونين (الشكل 4). ويمكن تحقيق هذا الأخير طالما أن المجموعات السكانية الفرعية من الفائدة يمكن أن تكون فردية في لمحات cytometric، PArticularly في المؤامرات نقطة. على سبيل المثال، وحتى الآن تمكنا لفرز مراحل مختلفة من خنزير غينيا meiocytes I 9، ولكن ليس للتمييز وفرز المجموعات السكانية الفرعية داخل السكان 2C ببساطة عن طريق تلطيخ DNA. جعلت الخلايا مرتبة RNA نوعية جيدة، والسماح المصب الفرق الجيني التحليلات التعبير 9 (الشكل 5).
كما يمكن أن يرى في وصف البروتوكول، فهي بسيطة جدا، واستنساخه بسهولة، ولا يتطلب الموظفين المهرة خاصة. ونحن نعتبر أنه يمكن اعتمادها لمجموعة واسعة من التطبيقات التي تشمل التدفق الخلوي أو لا. مجموعة من السابق بسيطة تحليل محتوى الخصية للفحص السريع للتقدم المنوية، للآخرين مع إعدادي تهدف مثل تنقية تدفق السكان خلية معينة للدراسات الجزيئية خفية، كما هو موضح هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل جزئيا من قبل CSIC (I + D المشروع C022) وPEDECIBA. الكتاب أود أن أشكر مارييلا Bollati وفالنتينا بورو من وحدة بيولوجيا الخلية (معهد باستور دي مونتيفيديو) لتعاونهم السخي بشأن فارز الخلية MoFlo، وميريال-مونتفيديو لتوفير بلطف جميع العينات خنزير غينيا المستخدمة في هذا المشروع. الشكل 1 وقد استنسخ بإذن من بيوميد الوسطى؛ الشكلين 2 و 3، والجدول 1 بإذن من S. KARGER AG، بازل، وأرقام 4 و 5 استنسخت أو تكييفها مع إذن من جون وايلي وأولاده، وشركة (حقوق الطبع والنشر التي يملكها ايلي بلاكويل، 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
- Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
