Samle og måle såreksudat biokjemiske mediatorer i kirurgiske sår

Summary

Denne artikkelen er en detaljert og visuell beskrivelse av en metode for å samle og måle biokjemiske inflammatoriske og nociceptive mediatorer ved kirurgisk sårstedet etter keisersnitt. Dette menneskelige bioassay har blitt brukt for å bestemme sammenhenger mellom såret og serum cytokin konsentrasjoner og narkotika-medierte endringer i såret cytokiner, chemokines og neuropetides.

Abstract

Vi beskriver en metodikk som vi er i stand til å samle og måle biokjemiske inflammatoriske og nociceptive mediatorer ved kirurgisk sårstedet. Samle stedsspesifikke biokjemiske markører er viktig å forstå sammenhengen mellom nivåer i serum og operasjonssåret, avgjøre eventuelle sammenhenger mellom megler utgivelse, smerte, bruk av smertestillende midler og andre utfall av interesse, og evaluere effekten av systemisk og perifer Drug Administration på operasjonssåret biokjemi. Denne metoden har blitt brukt til friske kvinner som gjennomgår keisersnitt levering med spinalanestesi. Vi har målt såreksudat og serum meglere på samme tidsintervaller som pasientens smerte score og smertestillende forbruk for opptil 48 timer etter keisersnitt. Ved hjelp av denne metodikken har vi vært i stand til å oppdage forskjellige biokjemiske mediatorer inkludert nervevekstfaktor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) substans P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 og MIP-1β. Studier som søker denne menneskelige operasjonssåret bioassay har funnet noen korrelasjon mellom såret og serum cytokin konsentrasjoner eller deres tid-utgivelsen profil (J Pain 2008;. 9 (7) :650-7) ¹ Vi har også dokumentert nytten av teknikk for å identifisere. narkotika-medierte endringer i såret cytokin innhold (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). ²

Introduction

Etter et kirurgisk innsnitt, bosatt og migrering betennelsesceller frigi pro-og anti-inflammatoriske cytokiner, prostanoider, neuropeptider og kjemokiner som er viktige for å initiere og opprettholde smerte. ^3,4 Evnen til å samle stedsspesifikke biokjemiske markører er kritisk for å bestemme forholdet mellom nivåer i serum og operasjonssåret, forstår det komplekse forholdet mellom mellommann utgivelsen og kirurgisk smerte, og for å være i stand til å evaluere effekten av både systemisk og perifer legemiddeladministrasjon på operasjonssåret biokjemi. Studier har fokusert på systemiske målinger av biokjemiske mediatorer og har ikke vurdert stedsspesifikke utgivelse. ^5,6 Serum målinger av cytokiner og chemokines kan ikke være representative for lokale kirurgiske sår biokjemiske hendelser og bare indikerer en global systemisk respons på kirurgisk skade. Denne artikkelen gir en detaljert og unik visuell beskrivelse av denne metoden som var edelgranst referert i 2008 i Journal of Pain. ¹ Målet med denne Jove artikkelen er å gi en unik og visuelt forbedret beskrivelse av metoder.

Protocol

1. Studien Protocol

• Skaffe Institutional Review Board godkjennelse og skriftlig informert samtykke.
• Velge en passende kirurgisk befolkningen for studien oppførsel. Denne metodikken har bare blitt brukt til keisersnitt sår, men de fleste kirurgiske sår ville være passende.
• Vurdere inkludering og ekskludering kriterier for studien deltakelse. Pasienter og prosedyrer med høy forekomst av kirurgiske sårinfeksjoner kan ikke være hensiktsmessig.
• Standardisere anestesi og postoperativ behandling for alle pasienter å unngå potensielle confounders.

2. Nociceptive og inflammatorisk Biokjemisk Mediator Collection

• Sett ON-Q PainBuster med ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) i underhudsfettet laget like før lukking av sår (andre vev lag kan bli vurdert). ON-Q PainBuster Pain Relief System leverer kontinuerlig vanlig saltoppløsning med en hastighet på 2 ml / time. Bæreren kan være kamstudere aggressiv med eller i forhold til narkotika av interesse som en lokal bedøvelse og ikke-steroide anti-inflammatoriske.
• Innlemme en standard tre-veis stoppekran i dette systemet for å tillate aspirasjon av såreksudat ved spesifiserte tidspunkter. Kontinuerlig infusjon hindrer kateteret fra clotting og forbedrer påliteligheten til systemet for å produsere eksudat prøver. Hvis aspirasjon av sekresjon er vanskelig (ca. 5% av tilfellene), bør du vurdere å trykke forsiktig over såret, endre motivets plassering (f.eks sitter pasienten opp eller ligger dem flate), ved hjelp av en 0,5-1 ml normal saltvannsskylling eller trekke den kateter 1-2 cm.
• Hos tidspunkter angitt av protokollen (f.eks, 1, 4, 6, 24, og 48 timer etter keisersnitt produksjonstid) Aspirer og trekke en ml såreksudat. Overfør eksudat til et polyetylen kopp inneholdende 30 ul proteinase inhibitor. Vi har brukt Komplett Proteinase Inhibitor (Roche biovitenskap, Palo Alto, California) for vårt formål.
• Innen 1 time av samlingen, sette prøvene på is og sentrifuger ved 3000 rpm i 10 min.
• Fjern serum og såret supernatanten og plasser i en standard mikrosentrifugerør og oppbevar ved -20 ° C.

3. Analysen Analyse

• Når all studien eksudat og serumprøver blir samlet inn og lagret, tine og analysere prøvene samtidig.
• Vi har målt cytokiner og kjemokiner ved hjelp av en multipleks immunoassay. Multipleks immuno-assay teknikk tillater oss å analysen mange analytter fra små (50 pl) volum prøver. Multiplekset produsere resultater sammenlignbare med de som oppnås med ELISA. Vi har brukt 17-plex Bio-PlexTM system (BioRad, Hercmodulene, CA) for vår analyse. Denne analysen kan måle tumornekrosefaktor α (TNFa), interferon α (INFα), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 2 (IL-2), 4 interleukin (IL-4), interleukin 5 (IL-5 ), interleukin 6 (IL-6), 7 interleukin (IL-7), 8 interleukin (IL-8), interleukin (IL-10), 12 interleukin (IL-12), 13 interleukin (IL-13), interleukin 17 (IL-17), granulocytt kolonistimulerende faktor (G-CSF), granulocytt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF), monocytt kjemotiltrekkende protein 1 (MCP-1), og makrofag inflammatorisk protein 1 (MIP-1β). Nervevekstfaktor ble målt med NGF DY256 antistoff ved å legge den til 17-plex plate med Bio-Plex amin kopling kit.
• For å sikre god kvalitet analyse, bør hver måling gjøres i duplikat. Standardkurver for hver analytt genereres ved hjelp referanse analytter levert av produsenten (ved konsentrasjoner på 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml plussen null-standard for normal saltvann). Standardkurver inngår i hvert løp og prøve konsentrasjonene beregnes med Bio-Plex Manager programvare.
• Substans P og prostaglandin E2 ble målt ved hjelp av høyt følsomhet ELISA Kits. Vi har brukt Assay Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan) for denne analysen. Utføre analysen i duplikat i henhold til produsentens spesifikasjoner.

Representative Results

Ved hjelp av denne metodikken har vi vært i stand til å detektere alle biokjemiske mediatorer skissert ovenfor med unntak av IL-5 i såreksudat og plasma. ^1,2 Noen ytterligere cytokiner ble ikke påvist i plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFγ , GM-CSF). ^en Tidsforløpet av målte cytokiner og chemokines i rapporterte studiene var konsekvent, nådde et platå i løpet av de første timene som ble påført for 24-timers observasjonsperiode .. ^1,2 Men NGF økt jevnt over 24-timers innsamling perioden, mens PGE2 maksimum innen 1 time og deretter jevnt redusert. ¹ Spesielt bemerkelsesverdig resultater markert redusert nivå av IL-10 og økte nivåer av substans P i sår innpodet med lokalanestetika bupivacaine, kompatibel med en samlet pro- inflammatorisk effekt av legemidlet (Figur 1). ² I en annen studie vi demonstrert at analgetiske forbruk etter keisersnitt delivery kirurgi var negativt korrelert med sårvæske IL-6, IL-1 β, og G-CSF-konsentrasjoner (Figur 2). ¹

Figur 1. Interleukin-10 (IL-10) og substans P såreksudat nivåer nivåer (pg / ml) målt på 1, 3, 5, 7 og 24 timer etter keisersnitt. Den fysiologisk saltvann gruppen er angitt i grå diamanter, og bupivacaine gruppen vises med svarte firkanter. * = Signifikant forskjellig mellom gruppene (P <0.005).

Figur 2. Korrelasjon mellom interleukin-6 (pg / ml) og morfin forbruk i den første 24-timers etter keisersnitt.

Discussion

Denne metodikken er beskrevet ovenfor er blitt funnet å være følsom nok til å detektere biokjemiske inflammatoriske og nociceptive mediatorer i såreksudat. Prøvetaking i ulike tidspunkter har også tillatt oss å observere endringer av disse meglere over tid. ^1,2 Vi er ikke kjent med at andre menneskelige operasjonssåret analyse som kan serielt måle frisettingsprofil av inflammatoriske og nociceptive meklarar i operasjonssåret eksudat. Resultater fra vår metodikk sårvæsken samling fra det kirurgiske innsnitt området er forskjellig fra studier utnytte avløp fra hofteleddet, ^7,8 som tyder på at subkutan såret mekler utgivelse kan være forskjellig fra intraartikulær eller andre kroppens hulrom biokjemisk mediator utgivelsen. I tillegg kan resultatene oppnådd i avløp bli forvirret av blodtap inn i såret, og vil derfor ikke kan gjenspeile lokal biokjemisk mediator release.

Den dårlig korrelasjon mellomsåret og serum demonstrerer viktigheten av å bestemme stedsspesifikke utgivelse når du studerer kirurgiske sår. Lokale endringer kan ikke vises systemisk grunn av mange faktorer, inkludert differensial systemisk og lokal produksjon i respons til kirurgisk traumer og stress. Selv om vi har valgt å måle et bestemt valg av pro-og anti-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner, samt NGF, SP og PG-E2 fra keisersnitt såreksudat, ^1,2 denne metodikken kan brukes til andre kirurgiske modeller og mange andre biokjemiske mediatorer.

Operasjonssåret lokalbedøvelse instillasjon er en vanlig brukt teknikk for å forbedre postoperativ smerte. ⁹ Anvendelse av metodikken, har vi vært i stand til å vise at lokal bedøvelse instillasjon i operasjonssår påvirker såret biokjemi. ² En reduksjon i IL-10 og økning i substans P i såret eksudater med bupivacaine instillasjon antyder et avbrudd of antiinflammatorisk modulering. Perifert administrert lokalanestetika kan dermed påvirke de inflammatoriske prosesser, ^10,11 som delvis kan utgjøre lokalbedøvelse-indusert chondrolysis i leddene etter operasjonen. ¹²

ON-Q PainBuster Pain Relief System er en US Food and Drug Administration (FDA) godkjente enhet siden 1998 som brukes for levering av lokalanestetika til operasjonssårstedet å redusere smerte etter operasjonen. Kontinuerlig såret instillasjon utnytte dette og andre katetre har ikke vært assosiert med økt sårinfeksjon. ^9,13 ON-Q PainBuster med ON-Q SilverSoaker er utformet for å sette narkotika og ikke gjentatte ganger prøve såreksudat. Selv om vi har hatt noen sårinfeksjoner med denne teknikken, understreker vi en aseptisk teknikk under prøvetaking såreksudat fra dette systemet. Vår foreslått endring til rette prøvetaking bør reserveres for forskningsformål og ikke for rutinemessig klinisk use. Vi anbefaler også at varigheten kateteret forblir in situ være begrenset til 48-72 timer.

Dette kirurgiske området bioassay teknikk gir en god modell for å forstå forholdet mellom inflammatoriske og nociceptive biokjemiske mediatorer i postoperativ smerte. Vi vil bruke metodikken i fremtidige studier for å undersøke effekten av lokalt administrert ikke-steroide anti-inflammatoriske medisiner og opioider. Teknikken kan også egner seg til undersøkelser som undersøker sårtilheling, overdreven kirurgisk arr og sårinfeksjon.