体外红血细胞溶血含量的生物大分子药物的细胞内交货的评价的pH响应Endosomolytic代理
Summary
溶血试验可作为一种快速，高通量筛选，药物传递系统的细胞相容性和内货物配送endosomolytic活动的。该试验测量作为环境pH值的函数的红细胞膜的破坏。
Abstract
内溶酶体膜泡的磷脂双分子层构成，可以构成一道屏障，细胞内的目标提供生物药物。为了克服这个障碍，已设计了一些合成的药物载体积极破坏核内体膜，并提供货物进入细胞质。这里，我们描述的溶血测定，这可以用作快速，高通量筛选的细胞相容性和endosomolytic活性的细胞内的药物输送系统。
溶血试验，人的红血细胞和试验材料共同模仿细胞外的，早期内体，和晚期溶酶体内环境的定义的pH值的缓冲液中温育。颗粒完整的红血细胞的离心步骤之后，释放到培养基中的血红蛋白量的分光光度测定（405nm的为最佳的动态范围）。 ％的红血细胞破碎，然后相对于阳性对照SAMP量化LES用洗涤剂溶解。在该模型系统中，在红细胞膜的脂双层膜的替代品，包围内溶酶体囊泡作为。期望的结果是可以忽略不计的在生理pH（7.4）和pH约为5-6.8的溶酶体内pH值范围从鲁棒溶血溶血。
Introduction
虽然有许多潜在的高影响力的治疗靶点在细胞内，细胞内输送的代理商带来了显着的挑战。通常，药物，尤其是生物制剂，被细胞内化，贩卖到囊泡，要么导致它们的内容通过内溶酶体途径降解，或穿梭出细胞通过胞吐作用。1在后者的方法中，内部的pH值囊泡酸化至约5-6，这是活性的酶的最佳pH值，在此室的功能，如溶菌酶2
最近，一些材料经过特别设计，以充分利用酸化胞浆内吞体，以方便他们的货物交付。这种方法的一个示例中使用合成的聚合物胶束的纳米粒子，其核心是在生理pH值（ 即 7.4），两性离子和电荷中性。然而，在pH 6.0- 6.5，聚合物成为质子化并购入的净正电荷，破坏了胶束的核心，和暴露的聚合物链段相互作用和破坏核内体膜。这项活动已经表明，以促进核内体逃逸的多肽和核酸为基础的疗法，让他们来访问他们的胞浆目标。3,4调解胞内逃生，破坏黏膜屏障的方法的例子包括“膜融合肽或介导膜融合或瞬态孔形成的蛋白质，可以在磷脂双分子层中。5均聚物的阴离子的烷基丙烯酸，如聚（丙基丙烯酸酸）是另一种被充分研究的方法，并且在这些聚合物中，羧酸侧基的质子化状态的决定过渡为疏水性，膜中断状态内溶酶体的pH值范围6,7。
一个有用的模型系统，为筛选endosomolytic行为是电子x体内pH-依赖的溶血试验。8在该模型系统中，红细胞膜的脂双层膜的替代品，包围内溶酶体囊泡作为。此一般化模型已被用于别人，到评估的endosomolytic的行为的细胞穿透肽和其它聚合物的基因传递系统。8-11在本实验中，在模仿在定义的pH值的缓冲液共孵育的人的红血细胞和试验材料胞外（7.4），早期内体（6.8），和晚期内溶酶体（<6.8）的环境中。潜伏期过程中释放的血红蛋白的量进行定量的红血细胞溶解，其被归一化到在阳性对照样品用洗涤剂裂解释放血红蛋白量作为衡量。
从一个小型图书馆的潜在的endosomolytic测试材料筛选，可以推断出，不产生溶血的样品，在pH值7.4，但显着升高下摆olysis在pH <6.5时，将是最有效的和细胞相容性的候选人胞浆药物递送。预计将保持惰性的，而不是不分青红皂白地破坏脂质双分子层膜（ 即可能导致细胞毒性），直到被暴露后的pH值下降到溶酶体内舱的内符合这些条件的材料。
在这个协议中，红细胞从人供体中分离，并在pH为5.6，6.2，6.8或7.4与实验endosomolytic药物输送剂共同孵育。完整的红细胞沉淀，上清液（含血红蛋白释放溶解红细胞） 经由板读数器（ 图1）为特征的血红蛋白的吸光度分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
的pH响应性聚合物或其他代理设计用于endosomolytic功能可以迅速和有效地筛选的基础上裂解过程中遇到的内体，在pH值的红血细胞（ 图1，pH为6.8 -早 期内体，pH值6.2 -晚期内含体，pH为5.6 -溶酶体）14-17 pH依赖性溶血已用于筛选进行调解内体释放的生物大分子的治疗药物（ 例如肽，的siRNA，反义寡核苷酸，蛋白质）的载流子的能力，并且该测定的结果，可以预测的性能?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
的承认通过国防部的资助，国会导演医学研究计划（＃W81XWH-10-1-0445），美国国立卫生研究院（NIH R21 HL110056），和美国心脏协会（＃11SDG4890030）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco’s PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
Referências
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
- Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
- Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
- Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
- Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
- Behr, J. -. P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
- Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. . Data for Biochemical Research. , (1986).
- Ernst, D. J. . Applied Phlebotomy. , (2005).
- Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
- Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
- Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
- Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
- Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
- Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
- Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
- Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
- Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
- Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Bioquímica. 25, 2231-2237 (1986).
- Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
- Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).
