Ex Vivo Red Blood Cell Hemolyse Assay voor de beoordeling van de pH-responsieve Endosomolytic Agenten voor Cytosolic Levering van Biomacromoleculaire Drugs

Summary

Een hemolyse assay kan worden gebruikt als een snelle, high-throughput screen van drug delivery systems 'cytocompatibility en endosomolytic activiteit intracellulaire lading levering. De test meet de verstoring van de erythrocyten membranen als functie van pH milieu.

Abstract

Fosfolipide dat endo-lysosomale blaasjes vormen kunnen vormen een belemmering voor de levering van biologische geneesmiddelen voor intracellulaire targets. Om deze barrière te overwinnen zijn een aantal synthetische drug carriers geconstrueerd om actieve verstoring het endosomale membraan en lading af te leveren in het cytoplasma. Hier beschrijven we de hemolyse assay die kan worden gebruikt als snelle, high-throughput screen voor cytocompatibility en endosomolytic activiteit van intracellulaire drug delivery systemen.

In de hemolyse assay worden menselijke rode bloedcellen en testmateriaal geco-incubeerd in buffers bij pH gedefinieerd dat extracellulaire, vroege endosomale en late endo-lysosomale omgeving nabootsen. Na centrifugatie stap pellet intacte rode bloedcellen, wordt de hoeveelheid hemoglobine in het medium afgegeven spectrofotometrisch gemeten (405 nm voor de beste dynamisch bereik). Het percentage rode bloedcellen verstoord wordt dan ten opzichte van de positieve controle samp gekwantificeerdles gelyseerd met een reinigingsmiddel. In dit modelsysteem de erytrocytenmembraan dient als een surrogaat voor het lipidebilaagmembraan die endo-lysosomale vesicles omsluiten. Het gewenste resultaat is verwaarloosbaar hemolyse bij fysiologische pH (7,4) en robuust hemolyse in het endo-lysosomale pH-traject van ongeveer pH 5-6,8.

Introduction

Hoewel er vele mogelijke high-impact therapeutische targets in de cel, de intracellulaire afgifte van middelen vormt een grote uitdaging. Vaak worden drugs, vooral biologische, geïnternaliseerd door cellen en verhandeld in blaasjes die ofwel leiden tot afbraak van de inhoud door de endo-lysosomale route, of back brachten de cel via exocytose. ¹ In de laatste werkwijze, de interne pH van de vesicles wordt aangezuurd tot ongeveer 5-6, met de optimale pH voor activiteit van enzymen die functioneren in dit compartiment, zoals lysozym. ^twee

Recent zijn een aantal materialen zijn speciaal ontworpen om gebruik te maken van de verzuring van endosomen te vergemakkelijken cytosolische levering van hun lading. Een voorbeeld van deze benadering maakt gebruik van synthetische polymeer micel nanodeeltjes die kern zwitterionische en lastenneutraal bij fysiologische pH (bijv. 7,4). Echter bij pH 6,0- 6.5, de polymeren worden geprotoneerd en zich een netto positieve lading die de micel kern destabiliseert en de blootgestelde polymeersegmenten interactie met en verstoren de endosomale membraan. Deze activiteit is aangetoond dat het endosomale ontsnappen van peptide en nucleïnezuur gebaseerde geneesmiddelen bevorderen, waardoor zij hun targets cytosolische openen. ^3,4 Andere voorbeelden van ontwikkelde methoden endosomale escape dat het membraan barrière verstoren bemiddelen omvatten "fusogenische" peptiden of eiwitten die membraanfusie of transient poriënvorming kunnen bemiddelen in de fosfolipide dubbellaag. ⁵ Homopolymeren van anionogene alkyl acrylzuren zoals poly (propylacrylic zuur) een goed bestudeerde benadering en in deze polymeren, de protonering staat hanger carbonzuur dicteert overgang in een hydrofoob, membraan-ontwrichtende staat in endo-lysosomale pH-bereiken. ^6,7

Een bruikbaar model systeem voor het screenen van endosomolytic gedrag is het ex vivo pH-afhankelijke hemolyse assay. ⁸ In dit modelsysteem de erytrocytenmembraan dient als een surrogaat voor het lipidebilaagmembraan die endo-lysosomale vesicles omsluiten. Dit model generaliseerbaar is door anderen om endosomolytic gedrag van cellen binnendringen peptiden en andere polymere genafgiftesystemen evalueren. ^8-11 In dit experiment menselijke rode bloedcellen en testmaterialen worden geco-incubeerd in buffers bij pH gedefinieerd dat nabootsen extracellulaire (7,4), vroege endosomale (6,8), en laat endo-lysosomale (<6,8) omgevingen. De hoeveelheid hemoglobine vrijkomt tijdens de incubatieperiode wordt gekwantificeerd als een maat van rode bloedcellen lysis, die is genormaliseerd naar de hoeveelheid hemoglobine model in positieve controlemonsters gelyseerd met een reinigingsmiddel.

Van het screenen van een kleine bibliotheek van potentieel endosomolytic testmateriaal, kan men afleiden dat de monsters die geen hemolyse produceren bij pH 7,4, maar significant verhoogd zoomolysis bij pH <6,5, zal de meest effectieve en cytocompatible kandidaten voor cytosolische drug delivery. Materialen die deze criteria past worden naar verwachting inert en niet zonder lipide dubbellaag membranen (bijv. waardoor cytotoxiciteit) vernietigen tot blootstelling aan een daling in de lokale pH na internalisatie in endo-lysosomale compartimenten.

In dit protocol worden erythrocyten geïsoleerd uit een menselijke donor en co-geïncubeerd bij pH 5,6, 6,2, 6,8 of 7,4 experimentele endosomolytic drug delivery agents. Intact erytrocyten worden gepelleteerd en de supernatanten (met hemoglobine bezit van gelyseerde erytrocyten) geanalyseerd voor de karakteristieke absorptie van hemoglobine via een plaatlezer (figuur 1).

Protocol

1. Voorbereiding en Sterilisatie van Buffers en Test Agenten 150 mM NaCl buffer: Los 4,383 g NaCl kristallen in 500 ml water nanopure. pH Buffers: voorbereiden fosfaat buffers bij pH 5,6, 6,2, 6,8 en 7,4 door het mengen van geschikte hoeveelheden monobasisch en dibasisch natriumfosfaat. Indien monsters worden getest bij lagere pH waarden (bijvoorbeeld pH <5,6) dan een geschikte buffer, zoals citraat buffer, worden gebruikt. Buffer recepten zijn direct beschikbaar, en een voorbeeld verzoe…

Representative Results

Typisch het ideale middelen die pH-afhankelijk gedrag vertonen hemolytische hebben het grootste potentieel voor cytosolische toediening van geneesmiddelen, nucleïnezuren en andere biologisch actieve moleculen. Dit wordt geïllustreerd door Agent 1 als afgebeeld in figuur 2, die minimale hemolyse vertoont bij pH 7,4, maar een sterke toename van hemolytische gedrag endosomale pH bereik (<6,5). Sommige middelen kunnen vertonen aanzienlijke mate hemolytische gedrag bij fysiologische pH bereik (Age…

Discussion

pH-gevoelige polymeren of andere middelen geschikt voor endosomolytic functie kan snel en effectief gescreend op basis van lysis van rode bloedcellen bij een pH aangetroffen in de endosoom (Figuur 1; pH 6,8 – vroege endosoom, pH 6,2 – late endosoom, pH 5,6 – lysosoom). ^14-17 pH-afhankelijke hemolyse werd gebruikt om het vermogen van vervoerders endosomale afgifte Biomacromoleculaire geneesmiddelen (bijv. peptiden, siRNA, ODNs, eiwitten) bemiddelen scherm en resultaten van deze assay …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes	Fisher Scientific	22-253-145	For blood collection
BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge	Fisher Scientific	02-665-31	For blood collection
BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter	Fisher Scientific	22-289-953	For blood collection
BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	For blood collection
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	For blood collection
Hydrochloric acid (conc.)	Fisher Scientific	A144-500	For adjustment of pH of D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Positive control
Dulbecco’s PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane	Fisher Scientific	09-740-44A
BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene	Fisher Scientific	08-772-2C	For plate-reading at the end of the assay.
BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene	Fisher Scientific	08-772-17	For incubation of red blood cells with experimental agents.