Summary
该协议介绍了一种改进的外植体的过程,涉及到
Abstract
皮层的发展涉及神经元和非神经元的元素,包括前体细胞,血管,脑膜和相关的细胞外基质之间的复杂的相互作用。因为它们提供了一个合适的器官环境,皮质切片外植体经常被用来调查这些控制神经细胞的分化和发育的相互作用,。虽然有益,片植模型可能遭受的缺点,包括的异常细胞层压和迁移。在这里,我们报告整个大脑半球外植体系统研究的早期视觉皮层的发展是比较容易准备比皮质片,并显示一致的器官迁移以及分层。在这个模型系统,早期的分层和迁移模式正常进行为期两天的体外 ,包括分裂的preplate期间,在未来的皮质层的六种形式。然后,我们开发前子宫穿孔 (EUEP)达到〜80%的成功率,针对发展中的背内侧皮质神经元GFP表达的方法。
的整个半球外植体模型皮质发育早期,电,药物干预和实时成像方法访问。这种方法避免了生存手术中子宫穿孔 (IUEP)的方法,同时提高转染和面目标的一致性。这种方法将有利于神经细胞增殖,迁移和分化的实验研究。
Introduction
哺乳动物的大脑皮层形式,通过连续产生的神经元的一致的增殖,迁移和分化。每个神经元是出生在脑室区(VZ)和迁移的VZ到中间区(IZ),形成皮质板(CP)1。他们通过不同的皮层区域,迁移神经元显示多种模式的迁移2,3依赖于细胞外环境和发展组织内的其他细胞成分( 如放射状胶质)。皮层神经元,然后逮捕迁移顶部的形成皮质板重合的过程神经元迁移逮捕和dendritogenesis 4。
皮质发育胚胎天11-13(E11-13)通过建立的原始丛状层或 preplate(PP),一个的先驱神经元层覆盖VZ之间开始。预期6层皮质神经元( 即第一个出生的皮层神经元在VZ),然后定位在一个刻板的模式,其胞体合并成一个不同的层内的PP 7。这些事件的preplate分割表面的边际(未来的皮质层1)和深区,后者组成的底板细胞(瞬态皮质层7)。这个过程,是一个基础性的事件在未来的增长大脑皮层8,被称为preplate分裂。
许多基因的突变已被确定,破坏皮质发育的各个方面,9。皮质发育也受到负面影响暴露摄入的毒素,如10可卡因和酒精11。由于在开发过程中出现的皮质畸形,有可能造成神经系统疾病( 如自闭症,精神分裂症),皮质发育的扰动所固有的实证调查LY重要的。因此,这是相当重要的建立方法来研究大脑皮质的发展,使快速检测基因或毒素的影响,但也保持分化的神经元,其他类型的细胞和细胞外基质(ECM)之间的相互作用,在这个早期阶段大脑发育12 。
切片外植体有13提供这样一个系统,并已被广泛用于测定皮层神经元的发展14-16。然而,切片化验可能遭受的缺点是不正常的神经元的迁移以及分层17可能是由于损坏的大脑发育和锚放射状胶质细胞的脑膜细胞包围。由于放射状胶质纤维是一种重要的基板皮质神经元迁移18中断的基底层,通过切片局部破坏放射状胶质架构和,导致皮质迁移改变。此外,SLI土木工程署的外植体表面的死细胞,可能会改变正常的组合物,在这些领域中的ECM提供的区域。
最近的方法都集中分析细胞在适当的健康的细胞类型和细胞外基质所包围的片位于深。然而,在某些情况下,这些新的方法可以要求原始厚培养切片冷冻切片或石蜡切片,使固定后的切片相对正常的内部提供用于分析19-21。原vibratome切片准备活的文化片固定片进行分析以及随后的cryosectioning,要求这些实验的关怀和努力工作。
皮质发育早期的研究提供了一种简单的,互补的方法,我们已经修改了现有的切片的方法13早期视觉皮层的发展促进研究。我们已经开发了一个whOLE半球外植体模式类似于现有的E14,在65转每分钟,并允许器官增长16〜18小时22,23涉及颤抖文化的整个半球模型。在我们的方法中,整个半球外植体放置在半透膜13与在高氧培养气氛21,24延长器官皮质生长48小时。这种方法还可以开发大脑皮质神经元的电一致。将胚胎从子宫中取出,并电穿孔引入质粒DNA和前脑,然后解剖。每个半球被隔离并置于内侧上的胶原蛋白涂覆的滤波器。然后,将外植体培养48小时的期间,一段时间,它包括第8 preplate分裂。在培养过程中,L6神经细胞前体分化的神经细胞,正确定位发展的皮质骨内。在此期间发展神经元周围环绕着相应的ECM和细胞类型,将对抗体内的相应单元格中 。该系统已经证明了宝贵的破译细胞事件,26层6的形成和preplate分裂7,25乙醇毒性的基础。
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Protocol
1。 前的子宫内 Electroporations与绿色荧光蛋白表达载体的构建
- 质粒DNA注射溶液的制备与CAG-eGFP的DNA 27 DDH 2 O中稀释至浓度为0.33毫克/毫升的最后工作使用Qiagen公司的Endo-免马克西Preps中纯化该质粒转化的细菌。快速绿色染料在约0.02%(w / v的最终)被添加到作为注射示踪的DNA溶液。
- 为了准备手术区,喷绒与台式和解剖显微镜下阶段的70%的乙醇溶液中,并擦干。喷手术剪刀和镊子解剖前,用70%的乙醇,并擦干。
- 定时怀孕的瑞士/韦伯斯特水坝被处死E13通过转移到一个腔室填充有CO 2从加压缸和监测大坝至少为1分钟,直到所有的运动停止。通过CO 2吸入牺牲后的胚胎从子宫中取出,并放置在一个10厘米的培养皿中含有冰冷的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中。
- 小心解剖每个胚胎从周围的胚外膜,并保持在冰冷的HBSS中。
- 单独每个胚胎转移到第二个10厘米培养皿含有冷的HBSS。用微量注射器注入2-3微升DNA快速绿色混合物入脑室,左侧大脑半球,照顾注入皮质区在空间上分开的皮质区,供日后分析。
- 若要electroporate,用钳子轻轻地按住胚胎,并轻轻放置在正的镊子电极的头部背中线并轻轻放置负胚胎下巴下面桨桨。 Electroporations实现一个BTX830电穿孔编程提供50 30 V的脉冲持续时间为50毫秒,950毫秒的间隔分开。这些设置的BTX830模型。根据制造商的指导书,其它的系统也可以使用纳秒。
2。整个半球外植体准备
- 电穿孔后的胚胎被放回冰冷的HBSS。从胚胎头使用两个#5珠宝商钳去除皮肤和软骨颅骨,大脑被删除。一个镊子,然后滑动下方的大脑从头骨中取出完整的大脑。然后,将电穿孔的半球(左)是远离大脑解剖和附加的脑组织中除去。在整个解剖过程的护理,以不损伤脑膜覆盖的左侧皮质半球。
- 一旦解剖每个胚胎转移用移液器有切口1毫升移液管尖,在HBSS中。半球轻轻地驱逐到胶原蛋白包被的培养插入。最多6个半球植安排内侧,每24毫米的插入。一旦设置后,除去过剩的HBSS从插入件和插入到一台35毫米的6孔板中,然后放置。以及包含EXActly 2.7毫升介质:DMEM-F12培养基含有Glutamax和补充有2%B-27,1%G5和1%青霉素 - 链霉素。可以滴上几滴以及媒体的每个外植体的顶部,但不超过原来的2.7毫升,每孔添加媒体。
- 一旦胶原过滤器已被放置到外植体的6孔培养皿中的外植体被放置到一个比卢普斯罗森堡(BR)的腔室(即还包含一个加湿水盘)。密封腔阻断和断开的95%/ 5%的氧/ CO 2气体供给管之前至少1分钟的95%/ 5%的氧/ CO 2气体的混合物被注入到腔室。 BR室,然后放入37℃的组织培养箱的培养周期的其余部分,1-2 DIV。
3。固定的外植体组织的组织学
- 在通风橱中准备的的帕加诺固定溶液由第一解磷8克多聚甲醛在100毫升预热的(〜80和de克; C)DDH 2 O。加入1-3滴浓NaOH,以促进溶,轻轻搅拌。一旦溶解,混合8%多聚甲醛溶液以1:1的溶液是500mM的蔗糖,100毫摩尔的Hepes,pH为7.4的50mM的MgCl 2,5 mM KCl中的最终浓度为4%的多聚甲醛在250 mM蔗糖的50mM的Hepes ,25毫摩尔MgCl 2,2.5 mM KCl中,pH值7.4。
- 要解决外植体的的帕加诺修复解决方案温暖至37℃。快速去除大部分的DMEM/F12媒体的每一种文化和每口井的外植体加5毫升的帕加诺修复的。确保完全覆盖每个外植体在修复。修正在室温下1小时。不要删除外植体过滤器前,固定1小时。
- 固定后删除Pagano的修复溶液和Pagano的修复(250 mM蔗糖的50mM的Hepes,25毫摩尔MgCl 2,2.5 mM KCl中,pH值7.4)的解决方案,无需更换。加入几滴10%的叠氮化钠,并储存于4℃下,直到嵌入。
4。嵌入和Sectioning组织学
- 准备10%的小腿皮肤明胶溶液的小腿皮肤明胶10克溶解在100毫升的温开水(55-60°C)。将明胶溶液的热板上设置为60℃,旋流定期直至溶解的。
- 倒入约10毫升的10%的明胶溶液中成一个10厘米的陪替氏培养皿的底部,允许30分钟固化。这将形成一个“垫”嵌入外植体。这些垫可以是预先制备的天,并在4℃下存储用尺子画一个表格,在培养皿的底部和个人外植体转移到每个方块的网格。取出残余的Pagano的溶液,用移液器,覆盖每个外植体用温水10%明胶溶液,并允许固化。恢复缓慢加入明胶溶液,直到每个外植体被完全包围由明胶,照顾,不熔化垫由添加太多温热一次明胶。允许明胶硬化〜1小时。一旦硬化的individUAL外植体,可以切割出小块明胶。块后固定在帕加诺解决之前切片用一个vibratome的24-48小时。
- 外植体在明胶块位于嗅球和在冠状面,在100微米厚的切片。的部分被收集和存储在PBS + 0.1%叠氮化钠,在4℃直至免疫组化处理。
- 通过传送部到24孔板中(每孔2-3节)进行免疫组化检测。第一数据块的非特异性结合的抗体,通过加入0.5毫升PBST + B(PBS + 0.5%的Triton X 100和2%BSA)到每个孔中,培养1小时,轻轻摇动。适当的主要抗体,然后稀释在PBST + B和0.4毫升,每孔中加入在RT下孵育过夜。主要是洗出与3X PBS洗至少10分钟。的二次抗体和2微克/毫升赫斯特33342核染色,然后在PBST + B和稀释样品在室温孵育2小时轻轻摇动。三的PBS洗涤(每次10分钟)被执行,并且然后幻灯片上使用90%甘油的50mM的Tris,pH7.4的,安装媒体被安装的部分。
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Representative Results
在整个发育期胚胎的啮齿动物皮层表现出的横向神经源性梯度,这样,横向的新大脑皮层是比较成熟的新皮层比背内侧28约1天。层6神经元的大部分被由此而产生( 即表现出他们的最终S相)的E12在外侧皮质(也称为场40 5)和E13在背内侧皮质(也称为字段1 5)中。 Preplate分裂开始后约1天,第6层神经元的产生,从而开始在外侧皮质皮层E14 E13和背。为了研究preplate分裂和皮质板发展的开始,我们修改了片外植体试验21,24,这样整个大脑半球培养通常从E13到E15( 图1)。
我们测试的的皮质外植体技术的可行性研究整个半球外植体Ð的增长erived从Tg(EOMES ::的eGFP)GSAT小鼠( 图2)。这款鼠标的菌株含有转基因报告未成熟的神经元的兴奋皮质血统7,29,30。制备整个半球皮层外植体在E13,在时间点之前preplate分裂在背新皮层( 图2A)。来自同一窝的皮质外植体,过了一段2 DIV下降固定顺序为后续的组织学分析和处理。点(DIV的0)在最初的分析时间,preplate分裂尚未发生在字段1(背新大脑皮质; 图2A,2E)。 1 DIV CP明显( 图2B,2C,2F,2G),并继续长大后2 DIV( 图2D,2H)。因此,整个半球的外植体培养初步支持在E13的为期两天的大脑皮层的成熟和,在背新皮层中捕捉preplate分裂。
为了确认标准背侧新皮层人组织学的发展,我们免疫染色2 DIV的外植体的硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs),细胞外基质的成分,这也是一个建立标记的PP和其衍生物对MZ和SP 8,31,32。免疫组织化学染色的CSPGs揭示CSPG免疫反应在背侧皮质指示适当分裂的PP到MZ和SP期间, 在体外培养期间( 图3A-3C)的两个频带。的PP被分裂由L6皮层神经元是已知的表达转录因子Ctip2和TBR1 7,33,34。这些标记物的免疫组化的模式( 图3D-3F,3G-I),分别确定合适的表达这些转录因子在新成立的CP。这些分析确认器官皮质发育早期在整个半球外植体。
在子宫内的 electroporations已被广泛用于测定细胞自主的基因的功能在显影皮层35。因此,我们测试是否电可以成功地转染的整个半球外植体模型的神经元。心脏左心室的完好E13胚胎注入0.33毫克/毫升CAG-GFP质粒,电穿孔(见方法)引入神经 元前体的质粒DNA导入该行侧脑室( 图1A)。 2 DIV后外植体下降固定和切片组织学分析。在这个时间点,表达GFP的细胞中观察到的所有皮质脑壁的区域内,( 图4A-4C)。可以观察到绿色荧光蛋白表达神经前体在VZ而强烈的绿色荧光蛋白表达细胞中观察到的IZ和CP。更重要的是,众多的GFP +观察神经元在顶部与新兴树突和轴突的形成CP。将细胞已形成了离散的层之间的界面处的CP和MZ indicatin克适当的迁移逮捕和复合( 图4A-4C,箭头)。树突延伸到对MZ,而皮层轴突延伸的下面的CP并进入IZ( 图4A-4C和图5,还可以看补充电影S1)。下面的分化细胞GFP +细胞的成熟,在不同的国家,包括与双极性形态,并列放射状胶质纤维的神经元及以下,多极神经元的IZ( 图4D,4F)。此外,观察到树突延伸到对MZ的ECM蛋白reelin的是适当的免疫定位( 图4G-4I)。因此,电和外植体条件允许的皮层神经元的正常发展阶段的前体神经元的未成熟大鼠神经细胞迁移。
在电穿孔的时间(E13)的100%的神经元产生的背新皮层VZ是L6神经元,这些神经元分裂的PP 5。成功的电穿孔需要,结构被引入到6小时的神经元在紧接之前或期间,M期的细胞周期中36。因此,预计,最早的有丝分裂后,GFP +背皮质E13电(场)的神经元,应填充成CP。观察到这样的神经元( 图4)表明,该协议能够可靠地定位L6为研究它们的迁移和成熟皮层神经元。
要估计的“成功率”的电/植过程中,我们分析到我们的实验室正在进行的调查。在该研究过程中,已被制备,21窝的外植体共248胚胎的电穿孔(如上面所述)与CAG-GFP,并从每个胚胎单个半球外植体的制备。的原始的248外植体,195(79%)被判断适合进行成像和分析。大约有一半的53无法分析的外植体,不表达GFP或GFP表达有误针对性的。剩余的损失畸形增长因外植体脱离的文化过滤器,或与组织处理的问题进行了解释。这成功率大约为80%( 图5),使适合的药理研究26,将外植体系统以及隐性突变7的分析产生不利影响的早期皮质发育。
图1。的整个半球外植体与前子宫穿孔的过程。A)E13小鼠胚胎注射的质粒DNA溶液电。的大脑解剖和横断了得sagitally的。将电半球,然后置于内侧向下的胶原蛋白涂覆的过滤器上,并培养2 DIV。然后可以被成像的半球活的或固定的组织学和随后的成像分析B)的照片的10个外植体,在6孔组织培养皿中的C)的6孔板中,与外植体被放置在一个高的氧环境放置在三个滤波器(95%O 2/5%CO 2)内比卢普斯罗滕伯格孵化室,然后将其放置在一个标准的37°C组织培养孵化。
图2。器官增长::绿色荧光蛋白的胚胎从一个单一的EOMES垃圾外植体在整个半球的皮层板A,E)A从下拉固定脑冠状切面开始的邪教。茜期(O DIV)。请注意,PP是本,但,那个CP尚未形成。 GFP的表达所产生的绿信号在未成熟的兴奋性神经元和蓝色是Hoechst染料标记的所有细胞的细胞核。B,F)。 CP生长,观察到由虚线表示,是0.5 DIV和增加由1 DIV(C和G)和2 DIV(面板D和H)。注意面板中的AD的GFP表达细胞域的厚度增加,表明的增殖和分化外植体的兴奋性神经元血统。比例尺条为500μm的(图A)和50微米(面板H)。缩写:CP,皮质板,IZ,中间地带MZ,边缘区,底板SP VZ,心室区。
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图3。整个半球的外植体。Preplate分裂AC)硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)免疫组化显示的分裂(分裂)的PP到的MZ。DF SP)的转录因子的Ctip2在新成立的CP的表达。GI)的表达在新成立的CP转录因子TBR1的。比例尺为50μm 面板中的C,F,I。
图4。 GFP表达GFP表达在整个半球植后子宫穿孔 E13 前 AC)后2格。注意皮层神经元的层,形成在顶部的CP(箭头)。DF)的巢蛋白(红色)immunoreactiv性的一段从整个半球外植体。GH)晕眩(红色)的免疫反应在一段来自整个半球外植体。 面板C,F,和我的比例尺是50微米。
图5。针对前的子宫内 electroporations背内侧皮质(场1)。变异 CAG-GFP的表达结构(0.33毫克/毫升)和整个半球外植体培养的11个胚胎从一个单一的垃圾电。AI)9 11植,在背内侧皮质的表达GFP。 ,虽然GFP的表达变化之间的外植体,在每个外植体GFP检测皮质区( 即 VZ,IZ和CP)。比例尺为50μm的板甲 。
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Discussion
我们改进和评价的实验模型 - 整个半球外植体 - 皮质发育早期的研究(E13-E15)。该模型已被证明有用的兴奋性神经元构成的大脑皮质25,37层的血统,迁移和分化的分析。的原理的系统的优点是:1)器官增长2 DIV,2)简单的准备,和3)的神经元的电穿孔,药理操纵和成像实验获得在这个早期,大脑发育的关键时期。我们使用文件系统的形态,方向和枝晶生长的6层皮层神经元过程中的分裂的preplate期间7,38细微的差别。
兴奋性神经元主要是由填充层6 corticothalamic投影神经元的提供互惠输入的丘脑39,40 41中的同步的参与功能。虽然这些神经元生理专业,6层的生成,运移和成熟的过程神经元股份中层2-6的皮质的兴奋性神经元的基本功能。具体而言,所有皮质的兴奋性神经元中产生的背端脑VZ,通过作为多极神经元的IZ迁移,并区分内的CP 7。兴奋大脑皮质神经元的成熟是由一组核心的顺序表达的转录因子PAX6,TBR2,和TBR1 29。这个顺序是共享的兴奋性神经元在2-6 42层,我们证实了适当的表达TBR1在新成立的CP( 图3G-3I)。因此,利用此方法,调查的6层皮质神经元的发展提供必要的洞察发展的神经RONS构成皮质层。
整个半球外植体补充现有的方法研究大脑皮质神经元的发展。此前的研究已经聘请了E14的整个半球植的方法来研究皮质发育为1 DIV 22,23。加上整个半球外植体与前子宫穿孔调查2天的皮质发育期间L6形成和preplate的分裂。相反, 在子宫内 electroporations在E13的前宫内 electroporations的整个半球植,的成功率更高:在我们的手中,我们实现〜80% 的成功目标向背侧前脑的电。此外, 在子宫内 electroporations需要生存手术,需要相当多的技术比整个半球子宫外的方法的努力。最后, 在子宫内的研究是不容易适合于精确的药理操作和成像方法。设置在交货或活化的药物和分子试剂(表达载体,沉默结构, 等 ),在规定浓度的精确时间控制整个半球的外植体,但是更难以实现在子宫内 。实时光学监控这样的操作所得到的效果,在微米范围内的空间分辨率,是现成与EUEP,但不IUEP的。这样的精确度可能涉及皮质的发育和功能的实验收集的数据的解释能力大幅提升。因此,对于研究整个半球外植体皮质发育早期实验具有明显的优势在子宫内的方法。然而,在这个时候,上层需要的皮层神经元和实验数据收集> 48小时,片植在子宫内的方法的研究仍然可取的。
有成功的的整个半球外植体技术的几个关键要求。首先,外植体的生长是高度敏感的机械完整性的脑膜。物理伤害脑膜( 即刺破或撕裂的)至少会影响当地发展的根本皮质。其次,外植体的生长以及培养内的介质的总体积是敏感的:太多媒体的外植体从过滤器脱离和中开发歪曲CP架构;太少媒体和外植体有可能进行脱水和遇到过多的细胞死亡。最后,我们已经证明目前的技术外植体皮质增长2 DIV。开始在E13发育时间窗口时,虽然承认了许多有价值的调查,限制分析,前一段时间,神经突触和规范通信。虽然在E14.5表达许多基因编码的皮层神经元突触蛋白(w.genepaint.org“目标=”_blank“>”www.genepaint.org“),突触不开始,直到E15〜在外侧骨皮质,这突触仅限于preplate细胞而非神经元的43层6。一些关键问题皮层突触的形成和功能,因此目前未寻址与的整个半球外植体系统。
总之整个半球外植体的制备可用于可靠和持续的调查皮质发育早期的遗传性脑畸形的小鼠模型。该技术是很容易适应的RNA干扰,短发夹RNA,和其他分子生物学和药理学操作。整个半球外植体是也适用于涉及施加的重组蛋白,药物和环境毒素的研究。
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Disclosures
作者宣称,他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项工作是支持NINDS(NS066071)和NIAAA的补助金。 (P50AA017823)ECO。作者感谢罗伯特·奎因和爱护动物实验室动物资源部的工作人员。我们感谢贾德森·贝尔蒙特的技术支持,妮可Belletier作为暑期大学生研究员(SURF)的援助。我们也感谢戴维·卡梅伦博士的意见和编辑的早期版本的手稿。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
H–chst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Equipment | |||
BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
Hamilton syringe (5uL) | Hamilton | 87930 | |
Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1" and style 4 |
Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
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