Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Summary

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Abstract

Mit dem Wunsch, die Beiträge von mehreren Zellelemente auf die Entwicklung eines komplexen Gewebe zu verstehen, wie die zahlreichen Zelltypen, die bei der Regeneration von Gewebe, Tumorbildung oder Vaskulogenese zu beteiligen, entwickelten wir ein mehrfarbiges Zelltransplantationsmodell der Tumorentwicklung in welche Zellpopulationen stammen aus verschiedenen fluoreszierend gefärbten Reportergen-Mäusen transplantiert und, gepfropft oder in und um einen Tumor zu entwickeln injiziert. Diese farbigen Zellen werden dann rekrutiert und in den Tumor Stroma eingearbeitet. Um die quantitative Erfassung Knochenmark Tumor Stroma-Zellen transplantiert wir GFP-exprimierenden transgenen ganze Knochenmark in letal bestrahlten Mäusen RFP exprimieren wie IACUC genehmigt. 0ovarian Tumoren, die orthotop in die transplantierten Mäusen injiziert wurden, wurden 6-8 Wochen nach der Transplantation entnommen und für die Knochenmark-Marker der Herkunft (GFP) sowie Antikörper-Markierungen, um Tumor-assoziierte erkennen analysiertStroma mit multispektrale Imaging-Techniken. Wir haben dann eine Methodik angepasst nennen wir MIMicc-Multispektrale Abfrage der Multiplex-Zellmassen mit multispektralen Entmischung fluoroprobes quantitativ zu beurteilen, welche Zelle kam, von dem ausgehend Populationen (basierend auf Original-Reportergens Etiketten), und unsere Fähigkeit, entmischen 4, 5 beschriftet , 6 oder mehr Spektren pro Folie steigt, haben wir zusätzliche Immunhistochemie mit Zelllinien oder Differenzierung, um eine höhere Präzision assoziiert aufgenommen. Den Einsatz von Software zu co-lokalisiert Multiplex-Fluoreszenzsignale, Tumor-Stroma-Bevölkerung verfolgt, aufgezählt und auf der Grundlage Marker Färbung charakterisiert werden zu erkennen. ¹

Introduction

Das Verständnis der Gewebeentwicklung und Reparatur ist wichtig, um die Aufklärung beteiligten zellulären Komponenten in der Wundheilung, ^2,3 regenerativen Medizin, Entwicklungsbiologie und Tumorbiologie. Unter Umständen, der Reparatur, zahlreiche Zelltypen zu infiltrieren das umgebende Mikromilieu in Vaskularisation, ECM-Ablagerung, Proliferation und Umstrukturierung des Gewebes zu unterstützen. Zellulären Faktoren und Phänotypen kann basierend auf Multi Multiplex-Marker, die die Lokalisierung identifizieren, Differenzierungsstatus und die Interaktion zwischen Zellkomponenten innerhalb des untersuchten Mikro identifiziert werden. Hier beschreiben wir die Tumorentwicklung als prototypisches Beispiel für diese multicolor-vielzelligen Transplantationsmodell gefolgt von multispektrale Bildgebung und Entmischung Methodik.

Tumorprogression ist ein mehrstufiger Prozess, der von mehreren erworbenen Fähigkeiten, die verbesserte Proliferation, eine umfassen markiertntiapoptotic, invasive und angiogenen Eigenschaften. ⁴ Tumorentwicklung wird durch nicht-neoplastischen Zellen, die in der Umgebung eingestellt werden, um Wachstumsfaktoren, strukturellen Matrix, Gefäßnetze und Immunmodulation bereitzustellen erleichtert. ^1,5,6 Diese Mikrohabitat besteht aus Zellen, abgeleitet von lokalen, benachbarten Geweben wie Fettgewebe und Blutgefäße und entfernten Quellen wie Knochenmark gewonnenen Zellen ^ein. Das Ausmaß der nicht-neoplastischen Zelle Aufnahme hängt von der Nachfrage aus dem Tumor, die oft mit der Bühne / Grad des Tumors entspricht. Um die Rolle der Tumormikroumgebung zu verstehen, muß man den Ursprung und das Differenzierungspotential der nicht-neoplastischen Zellpopulationen verstanden.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um bei der Interpretation der Tumorprogression durch die Visualisierung der beiden Knochenmark abgeleiteten Zellkomponenten zu unterstützen und die lokale Gewebe derivED-Zellen. Mit Hilfe fluoreszierenden Reporter-Gen-exprimierenden transgenen Mäusen transplantiert wir GFP (grün-fluoreszierenden Proteins) Knochenmark in einem letal bestrahlten RFP (rot-fluoreszierende Protein) Maus. Nach der erfolgreichen Knochenmark Transplantation wird eine syngene Tumorzelllinie orthotop injiziert und für 4-8 Wochen einprägen. Die daraus resultierende Tumor aus der Maus herausgeschnitten und für Immunfluoreszenz-(IF)-Färbung, die Stroma-Komponenten visualisieren verarbeitet. Multiplex-IF-Marker ist eine häufig verwendete Technik, die signifikante Optimierung ^7-9 beinhaltet, jedoch unter Verwendung eines multispektrale Bild / Entmischung Plattform verbessert das Potential für fluoreszierende Markerkombinationen, die spektrale Überlappung aufweisen. Hier stellen wir eine Technik, die wir nennen MIMicc-Abfrage von multispek Multiplexed Zellzusammensetzungen zu färben und zu analysieren, bis zu acht Marker innerhalb eines Tumors Abschnitt auf einer einzelnen Folie, um die zelluläre Herkunft, Zelldifferenzierung st analysierenATUS und Zell-Zell-Wechselwirkungen von Komponenten innerhalb der Tumormikroumgebung. Dieses vereinfachte Beispiel hat das Potential auf, um fünf, sechs oder mehr Markern unter Verwendung von Antikörpern oder intrazelluläre Fluoreszenz Promotor getriebene Expression. Tabelle 1 zeigt potentielle Fluoreszenzantikörperfärbung Kombinationen mit geeigneten Arten berücksichtigt analysieren erweitert werden.

Protocol

Syngene Murine Knochenmarktransplantation (KMT), wie von institutionellen IACUC Protokolle zugelassen (Hinweis: Der Erfolg dieses Protokoll erfordert den Einsatz aller markierten Zelltyp (en) als Ziel für die multispektrale Analyse und die nachgelagerten Analyse zu erleichtern, kann man die genetische nutzen oder stabilen Zellmarkierung. Wir schlagen vor, dass jede Zelle, Gewebe, Organ-oder-zu-sein kann zu einem Transplantationsmodell und die Transplantation kann so viele einzigartige markierten Popula…

Representative Results

Mit einem multispektrale Imaging-Technik, um Tumore in unserem BMT transgenen Mausmodell eingepflanzt zu analysieren, können wir Stromatumoren Komponenten, die von Knochenmark Herkunft zu erkennen. Die Anfangs BMT wurde 3 Wochen nach der Transplantation mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 1) bestätigt. Orthotop injiziert unmarkierten Eierstock-Tumoren nach Transplantation BMT Bestätigungen wurden herausgeschnitten und Formalin fixiert 6 Wochen nach der ersten Tumorinjektion. Paraffin eingebettete…

Discussion

Hier beschreiben wir die Anwendung der multispektralen Bildgebung beschreiben wir, wie multispektrale MIMicc-Abfrage der Multiplex-Zellmassen, die Knochenmark Stromazellen Komponenten der Tumor-Mikroumgebung zu analysieren, aber diese Methode und Konzept kann auf die Entschlüsselung anderen zellulären Elemente, die eine komplexe Komposition angewendet werden Gewebe, wie sie bei Wundheilungsreaktionen oder während eines regenerierbaren Gewebes gesehen. In diesen Experimenten verwenden wir transgene Mäuse fluoreszenz …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
			Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml