Сложные массы ткани, из органов к опухолям, состоят из различных клеточных элементов. Мы выяснены вклад сотовых фенотипов в ткани с использованием мульти-меченых флуоресцентными трансгенных мышей в сочетании с окрашиванием многопараметрических иммунофлуоресцентным последующим спектральным несмешивания расшифровать клеток происхождение, а также характеристики клеток, основанные на экспрессии белка.
С желанием понять вклад нескольких клеточных элементов в развитие сложной ткани, такие, как многочисленных типов клеток, участвующих в регенерации ткани, образование опухолей, или васкулогенез, мы разработали разноцветные сотовой трансплантата модель развития опухоли у которые популяции клеток происходят из различных флуоресцентно цветных гена-репортера мышей и пересаживают, привиты или вводят в и вокруг развивающейся опухоли. Эти цветные клетки затем на работу и включены в строме опухоли. Для того, чтобы количественно оценить костного мозга стромальные клетки опухоли, мы трансплантировали GFP выражения трансгенного весь костный мозг летально облученных в RFP, экспрессирующих мышей, утвержденной IACUC. 0ovarian опухоли, которые были ортотопически вводили в трансплантированных мышей вырезали 6-8 недель после приживления и анализировали на маркера костного мозга происхождения (GFP), а в качестве маркеров для выявления антител, ассоциированных с опухольюстромы с помощью мультиспектральных методов визуализации. Затем мы адаптировали методику мы называем MIMicc-Мультиспектральный Допрос мултиплексу сотовых композиций, используя мультиспектральных расслоении fluoroprobes количественно оценить, какие помечены ячейки пришли из которых, начиная населения (на основе оригинальных гена-репортера этикеток), и, как нашей способности unmix 4, 5 , 6 или более спектры в увеличении слайд, мы добавили дополнительную иммуногистохимию связанный с клеточных клонов или дифференциации повышения точности. Используя программное обеспечение для обнаружения совместно локализованные уплотненные-люминесцентные сигналы, популяции стромальных опухолей можно проследить, перечисленные и характеризующиеся на основе окрашивания маркера. 1
Понимание развития и восстановления тканей имеет важное значение для выяснения, участвующих клеточные компоненты в заживлении ран, 2,3 регенеративной медицины, биологии развития и биологии опухоли. В условиях ремонта, многочисленные типы клеток проникнуть в окружающую микросреду, чтобы помочь в васкуляризации, осаждения ECM, пролиферации и реструктуризации ткани. Клеточные факторы и фенотипы могут быть определены на основе многопараметрических, мультиплексированных маркеров, которые могут идентифицировать локализацию, состояние дифференциации и взаимодействия между клеточными компонентами в пределах исследуемого микросреды. Здесь мы описываем развитие опухоли как прототип, например, для этого многоцветного-многоклеточные модели трансплантации последующим мультиспектральных изображений и спектрального методологии несмешивания.
Прогрессия опухоли является многоэтапный процесс, который характеризуется несколько приобретенных возможностей, которые включают повышенную пролиферацию, а,ntiapoptotic, инвазивные и ангиогенные свойства. 4 Развитие опухоли способствует неопухолевых клеток, которые набранных в окружающую среду, чтобы обеспечить факторы роста, структурные матрицы, сосудистых сетей и иммунную модуляцию. 1,5,6 Это микросреда состоит из клеток, полученных из местные, соседние ткани, такие как жировой, и кровеносные сосуды и далекие источники, такие как костного мозга, полученных клеток 1. Степень неопухолевых включения клеток зависит от спроса со стороны опухоли, которая часто соотносится с этапа / сорта опухоли. Чтобы понять роль опухоли поддерживающей микросреды, нужно понять происхождение и дифференциации потенциал населения неопухолевых клеток.
Этот протокол был разработан, чтобы помочь в интерпретации опухолевой прогрессии через визуализации обеих костного мозга, полученных клеточных компонентов, и местные DERIV тканиред клетки. Используя флуоресцентные репортер генов, экспрессирующих трансгенных мышей, мы пересадили GFP (зеленый-флуоресцентный белок) костного мозга в летально облученных RFP (красно-флуоресцентный белок) мыши. После успешного приживления костного мозга, сингенными линия клеток опухоли вводится ортотопически и позволило привить в течение 4-8 недель. В результате опухоль вырезали из мыши и обработаны для иммунофлуоресцентного (ИФ) окрашивания для визуализации стромальных компонентов. Мультиплексирование ЕСЛИ маркеры является широко используемым методом, который включает в себя значительную оптимизацию 7-9, однако с использованием мультиспектральных изображений / несмешивания платформу улучшает потенциал для люминесцентных комбинаций маркеров, которые обладают спектральной перекрытие. Здесь мы представляем технику мы называем MIMicc-мультиспектральный допрос мултиплексу сотовых композиций для окрашивания и анализировать до восьми маркеров в рамках секции опухоли на одном слайде для анализа клеточных происхождение, клеточной дифференцировки улАТУС и межклеточные взаимодействия компонентов внутри микросреды опухоли. Это упрощенный пример имеет потенциал, чтобы быть расширена на для анализа пять, шесть или более маркеров, использующие антитела или внутриклеточная промоутер управляемой люминесцентные экспрессии. В таблице 1 приведены потенциальные люминесцентные комбинаций окраски антитела с соответствующими видами учитывать.
Здесь мы опишем применение мультиспектральных изображений мы описываем как MIMicc-многоспектрального допроса мултиплексу сотовых композиций, проанализировать костного мозга стромальных компонентов микросреды опухоли, однако эта методология и концепция может быть применена к расшифр…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны обсуждений руководством и при поддержке доктора. Майкл Andreeff MD, PhD., И Джаред Беркс кандидат. от MD Anderson проточной цитометрии и визуализации клетки основной комплекс. Эта работа была частично поддержана грантами от Национального института рака (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 и CA109451 для ТСМ. ELS также поддерживается армии Министерства обороны (BC083397).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||||||||||||||||
.2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
|