Isolering, bearbeiding og analyse av Murine Gingival Cells
Summary
Studien beskriver en effektiv teknikk for å isolere og behandle gingivale vev fra mus munnhulen for å produsere en enkelt-cellekultur. De resulterende celler kan videre brukes for strømningscytometri-analyse og molekylære studier.
Abstract
Vi har utviklet en teknikk for å nettopp isolere og behandle murine gingival vev for flowcytometri og molekylære studier. Gingiva er et unikt og viktig vev for å studere immun-mekanismer fordi det er involvert i vertens immunrespons mot oral biofilm som kan forårsake periodontale sykdommer. Videre muliggjør nærhet av gingiva til kjevebenet vev også studere bein ombygging i henhold inflammatoriske tilstander. Vår metode gir store mengder immunceller som gjør at analyse av selv sjeldne celle populasjoner som Langerhans celler og T-regulatoriske celler som vi viste tidligere en. Anvender mus til å studere lokal immunrespons som er involvert i alveolar bentap i løpet av periodontale sykdommer er fordelaktig på grunn av tilgjengeligheten av ulike immunologiske og eksperimentelle verktøy. Ikke desto mindre, på grunn av deres lille størrelse og den relativt upraktisk adgang til det murine gingiva, unngås mange studier undersøkelse av this kritisk vev. Metoden som beskrives i dette arbeidet kan rette gingival analyse, som forhåpentligvis vil øke vår understating på den orale immunsystemet og dets rolle i løpet av periodontale sykdommer.
Introduction
Gingiva er det myke vevet rundt den cervikale parti av tennene og dekker den alveolar-prosessen (Figur 1). Gingiva er en type masticatory slimhinnene som kan separeres ytterligere i mukosalt epitel og bindevev (også kjent som submucosa eller lamina propria). Den anatomiske oppbygging av gingiva og nabotenner tillater bakterier å oppholde seg og utvikle plakk (biofilm) som stadig utfordrer det lokale immunsystem. Som et resultat utvikles inflammatorisk reaksjon i gingiva, hvilke i visse tilfeller blir destruktivt – en tilstand som betegnes periodontale sykdommer 2. I utgangspunktet kan plakk-induserte periodontale patologier deles inn gingivitt og periodontitt. Gingivitt representerer en reversibel tilstand av lokal betennelsesreaksjon som er begrenset til gingiva. Periodontitt, på den annen side, er en irreversibel destruktive prosess hvor festeanordningen (kjevebenet, periodontalligament, cementum og gingiva) er ødelagt tre.
Gingiva ble foreslått å tjene både som effektor og induktiv områder under periodontale sykdommer fire. Humane studier har antydet at i respons til dental plakk, immun effektorceller og molekyler dynamisk infiltrert eller avreise gingiva 5-7. Denne aktiviteten ble vist seg å spille en viktig rolle i periodontal ødeleggelse 8,9. Mens data generert av disse studiene gitt verdifull informasjon om dette patologisk prosess, som arbeider med menneskelig vev har store etiske, tekniske og eksperimentelle begrensninger. Utvikling av eksperimentelle modeller tillatt årsak-virkning eksperimenter via ansette transgene mus og in vivo intervensjoner 10. Som et resultat av økt vår kunnskap om mekanismene som er involvert i periodontal sykdom betraktelig i løpet av de siste to tiårene. Ikke desto mindre, på grunn av kompleksiteten av periodontale sykdommer, er deten pågående debatt om innholdet i den lokale immunresponsen tilrettelegge vev ødeleggelse. Det er også en mangel i vår forståelse av funksjonen av sentral immunceller i gingiva i løpet av periodontale sykdommer. Det er således viktig å studere patologiske inflammatoriske hendelser i målvevet av sykdommen, gingiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Maxilla gingivale vev oppnådd fra en enkelt mus er tilstrekkelig for å analysere sub-populasjoner av T-og B-lymfocytter, så vel som deres evne til å uttrykke ekstracellulære og intracellulære molekyler som vi tidligere beskrevet en. Likevel, hvis sjeldne celle populasjoner er av interesse (for eksempel DCS), anbefales det å samle vev 2-3 mus. Til opplysning, hvis ønskelig, er det mulig å skrelle både palatale og gingivalt vev og deretter å skjære gingiva (en modifikasjon av trinn 1.8 til 1.9). Det…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra Israel Science Foundation (nr. 1418/11) til AHH og (nr. 1933/12) til AW, den tyske israelske stiftelsen for unge forskere (GIF Young) til AHH, og Dr. I . Cabakoff Forskning Endowment Fund ved Hebrew University-Hadassah School of Dental Medicine til AHH og AW.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
Referências
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
