Summary
Hasret hücreler (DPS) gelen DNA-bağlayıcı protein bakteriyel stres mücadelede önemli bir rol oynar. Bu makalenin arıtma ele
Abstract
Oksidatif stres aerobik yaşamın kaçınılmaz bir yan ürünü. Moleküler oksijen karasal metabolizması için gereklidir, ama aynı zamanda canlılar içinde birçok zararlı reaksiyonlar yer almaktadır. Yaşam için başka önemli bir bileşiktir aerobik metabolizma ve demir, kombinasyonu Fenton kimya ile radikaller üretmek ve hücresel bileşenleri azaltmak için yeterlidir. DNA tamiri çok önemsiz olduğu gibi DNA bozulması, belki hücre içi radikaller içeren en çok zarar veren bir süreçtir. Bu makalede sunulan tahlil radikal aracılı DNA hasar molekülleri ve enzimlerin etkisini ölçmek ve görselleştirmek için nicel bir teknik sunmaktadır.
DNA koruma deneyi protein ya da kimyasal koruyucu özelliklerinin in vitro karakterizasyonu için, basit, hızlı ve güçlü bir araçtır. Bu zararlı oksidatif reaksiyona DNA açığa çıkar ve çeşitli bileşik konsantrasyonları eklemeyi içerir. Bileşik konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, DNA hasarının azaltılması veya artışa daha sonra jel elektroforezi kullanılarak görselleştirildi. Bu yazıda aç bırakılmış hücreler (DPS) DNA-bağlayıcı proteinin koruyucu özelliklerini ölçerek, DNA koruma deneyi tekniğini göstermektedir. Dps güçlü çevresel stres ile mücadele için 300'den fazla bakteri türleri tarafından kullanılan bir mini-ferritin olduğunu. Burada DPS arıtma protokolü ve DPS tarafından DNA koruma değerlendirmek için optimize edilmiş test koşulları sunuyoruz.
Introduction
Aerobik organizmalar sürekli olarak DNA hem de diğer önemli biyolojik makromoleküllerin zarar verebilir reaktif oksijen türleri ile uğraşmak gerekir. Oksidatif hasar toksik etkilerini ortadan kaldırmak için bir güçlü bir araç hasret hücreler (DPS) DNA-bağlayıcı proteindir. Hasret E. 1992 yılında keşfedilmesinden bu yana coli kültürü 1, DPS bakteri ve Archaebacteria 2 300'den fazla türün tespit edilmiştir. Sabit faz sırasında DPS Massive upregülasyonu bu E. en çok ifade nükleoit-ilişkili protein yapar açlık koşulları 3, 4 altında coli. Buna ek olarak, DPS açlık, yüksek demir konsantrasyonu, UV ışığına maruz bırakma, ısı şoku ve oksidatif stres 5, 6 da dahil olmak üzere pek çok çeşitli stres sırasında bakteriyel canlılığı ve DNA bütünlüğünü korumak için de gösterilmiştir.
12 monomerlerin, w istikrarlı bir homo-oligomerik kompleksi içine Yapısal olarak, DPS kendini ortaklarıhich bir küresel içi boş kabuk içine monte. ~ 4.5 nm çapında iç boşluğu küçük moleküllerin 7 geçişine izin gözenekleri ile çözücü dış erişilebilir, ve demir 8 gibi mineralli metaller ayırmak olabilir. DPS koruyucu etkisi non-spesifik DNA bağlayıcı 1, ferroxidase aktivite, ve demir depolama 8 de onun çeşitli biyokimyasal faaliyetleri, türemiştir.
DPS yararlı biyokimyasal faaliyetlerin ayrıntılı çalışma ilk olarak arıtma gerektirir. DPS sadece başka proteinler ayrı olarak, aynı zamanda herhangi bir bağlı DNA'nın 7 olması gerektiği gibi DPS saflaştırma, karmaşık bir işlemdir. Optimize edilen saflaştırma işlemi, iki iyon değişim ve amonyum sülfat ile çöktürme kademesi oluşan, çok yaygın teknikleri kullanır. Son derece konsantre DPS düşük tuz koşullarında çözüm dışında hızlandırabilir gibi çeşitli tampon değişim, ihtiyaç vardır. Bir kez DPS saflaştırılmış protein edilmiştir, Bu doğrudan ferroxidase aktivitesi 8, DNA bağlayıcı stokiyometri 9 ve 10 demir bağlama mekanizmaları ölçmek deneyleri ile uygulanabilir. Saf DPS de diğer potansiyel uygulamalar vardır. DPS sabit içi boş küresel yapısı, proteinin boşluğu 11 içine hidrofobik parçacıkların depolamak için iskelesi olarak kullanılmış ve bir reaksiyon haznesi yeni bir manyetik nano partiküller 12 sentezlemek için bile.
Reaktif oksijen türleri nedeniyle zarar arabuluculuk DPS bir koruyucu yeteneği açıkça olması ve doğrudan DNA koruma deneyi 13, 14 ile ispat edilebilir. Demir Fenton kimya ile H 2 O 2 bozulması katalize zaman in vitro prosedüründe bu, radikal türleri üretilmektedir. Bu radikaller doğrudan reaksiyon DNA mevcut zarar ve tamamen yüksek konsantrasyonlarda bu düşürebilir. İki anahtar DPS faaliyetleri doğrudan Fent etkilerini karşı olabilir hemon-aracılı radikal üretimi. DPS sürecinde mevcut hidrojen peroksit tüketen, mineralizasyon ile katalitik demir konsantrasyonunu düşürür. Ayrıca, DNA bağlayıcı DPS potansiyel radikal hasarına karşı fiziksel olarak korumak ve daha az reaktif yüzey alanına sahip daha küçük bir hacim içine yoğunlaştırır olabilir. Bu iki özellik kombinasyonu de koruyucu DPS aktivitesinin ölçülmesi amacıyla, uygun DNA koruma deneyi yapar.
DNA koruma deneyi oldukça çok yönlü ve DPS karakterizasyonu ötesinde çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Radikal hasar hücrelerinde stres yaygın bir şeklidir, ve birçok farklı protein ve kimyasalların, önlemek için kullanılır. Radikal hasarı için bir belirteç olarak DNA bütünlüğü kullanılarak tahlil genel ilkesi, hemen hemen her türlü radikal üreten reaksiyon ya da mücadele maddesi ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Diğerleri arasında, tahlil, başarılı bir şekilde bir anti-oksidatif özelliklerini belirlemek için kullanılmıştırK. hidroksil zarar arabuluculuk 16 ürik asit etkilerini karakterize etmek ve Kürk transkripsiyonel regülatör proteinlerin 17 fonksiyonu yeni bakış açıları kazanmak için gıda sektöründe 15, kullanılmak üzere Paniculata özü.
Yayınlanan gazetelerde testin çeşitli kullanımlarını rağmen, ilk kez birçok araştırmacı için gereksiz yere zahmetli bir süreç için tahlil kurma yapar, birçok optimizasyon ve sorun giderme adımları gerekli olduğunu bulundu. Bu makalede mevcut protokol giriş için bu engeli kaldırmayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dps İfade ve Arıtma
Yüksek saflıkta protein elde DNA-koruma deneyi için önemli bir ilk adımdır. DPS protein saflaştırma, 4-5 gün içinde gerçekleştirilebilir.
- E. Bir proteaz eksikliği olan gerginlik Dönüşümü DPS protein-kodlama sekansı klonlanmıştır içine pET vektörü (örneğin pET17 gibi) coli (örneğin, BL21 (DE3) pLysS gibi).
- Çizgi uygun antibiyotik (örneğin, 1.1 'de verilen örnekler için, ampisilin ve kloramfenikol gibi) içeren Luria Broth (LB) agar plakaları üzerine hücreleri transforme. 37 gece boyunca inkübe ° C
- Uygun antibiyotikler ihtiva eden LB ortamı, 30 ml içine plakadan tek bir koloni inoküle. 37 gece boyunca inkübe ° C 200-250 rpm sallayarak.
- 10 ml gecelik kültürü her biri ile uygun bir antibiyotik içeren 2 x 1 L LB vasatı inoküle. OD 600, sallayarak ise, 37 ° C de büyümeye
- 15 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. Indüklenen hücre kültürü L başına DEAE tampon A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM NaCI, 0.1 mM EDTA) içinde 7.5 ml hücre topakları yeniden süspanse edin. Örnekler sıvı nitrojen içinde dondurulur ve arzu edildiği takdirde, -80 ° C'de saklanabilir. Bu prosedür daha sonra 4 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde örnekleri eritilmesi ile devam edilebilir
- Aşırı ekspresyona DPS bozulmasını önlemek için hücre süspansiyonu proteaz inhibitörleri (örneğin, Calbiochem grubu III proteaz inhibitörleri olarak, hücre süspansiyonu, ml başına 0.167 ul) karışımı ekleyin.
- Bir Fransız basını kullanarak hücre-ücretsiz özü hazırlamak. 20 ml DEAE Tampon A (sürekli-akış modeli kullanıyorsanız), daha sonra sınıfta yıkıcı ile Başbakan Fransız basınıt 20 kpsi az iki kez örnek. Çözünmeyen parçacıkların açıklamak için 4 ° C'de 35 dakika boyunca 30,000 x g'de santrifüj lizat ve süpernatant kaydedin. İstenirse Süpernatant daha sonra, sıvı azot ile dondurulmuş ve -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Bir FPLC DEAE ile tampon A ile 30 ml'lik bir DEAE-Sefaroz CL-6B kolonu, dengelenmesi. Arka plan üzerinde 0,2 MPa arasında bir maksimum basınç ile 1-2 ml / dk 'da sütun üzerinden tampon çalıştırın. Sütun üzerine hücre ücretsiz özü yük ve akış yoluyla OD 280 sinyal temel üzerinde artmaya başladıktan sonra toplamaya başlar. DEAE Tampon ile sütun yıkayın bir sürekli akış yoluyla toplarken OD 280 değeri, temel dönene kadar. Akış yoluyla bağlı DNA'dan serbest DPS proteinin, içermelidir. % 100 tampon B (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 M NaCI, 0.1 mM EDTA) ile sütun yıkayın. Bu eluat DPS-DNA kompleksleri gibi diğer proteinler içerir ve atılabilir.
- Reklamı kaldırınamonyum sülfat çöktürme yoluyla protein ditional kirletici. Toplanmış akış yoluyla hacmi belirleyin. Yavaş yavaş (10-20 dakika arasında bir süre boyunca) 4 az% 62 doygunluk (solüsyonun ml'si başına 390 mg), ° C de karıştırılarak kuru bir küçük taneli amonyum sülfat ekleyin. Tüm dengeleme sağlamak için amonyum sülfat son bölümü ilave edilmesinden sonra, 20-30 dakika boyunca karıştırılır. Kirletici proteinlerin çözeltiden çökelebilir olurken DPS, çözünür olmaya devam edecektir.
- 4, 30 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj ile Çöken proteinler çıkarmak ° C ve süpernatan kaydedin.
- Yavaş yavaş% 94 doygunluğa ulaşmak ve tam denge sağlamak için 20-30 dakika süreyle karışmaya süpernatan ml'si başına ek bir 227 mg amonyum sülfat ekleyin. DPS bu yüksek tuz konsantrasyonunda çökelir ve 4 ° C de 30 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj ile toplanabilir DPS pelet olacak, süpernatant ekarte edilebilir. Pelet -80 saklanabilir ° C eğer desIRED.
- Tabanda tampon içinde DPS-içeren pelet (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM NaCI, 0.1 mM EDTA) yeniden süspanse edin. 2.5 ml örnek ses seviyesini ayarlayın.
- Tampon değişimi, bir PD-10 jel filtrasyon kolonu kullanılarak amonyum sülfat kaldırın. 25 mi tabanda tampon ile jel yatağı dengelenmesi. PD-10 sütunun üstüne DPS örnek 2.5 ml uygulayın ve Flow-through atın emmek sağlar. 3.5 mi tabanda tampon ile yıkanarak DPS toplayın.
- 4, 10 dakika boyunca 16,000 x g'de tampon ile-yer değiştirilmiş örnek Santrifüj ° C çözülmeyen bileşenler kaldırmak ve 6-10 ml seyreltme tamponu (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 0.1 mM EDTA) ile seyreltin sağlamak için bu Tuz konsantrasyonu DPS SP Sepharose kolonuna bağlamak için yeterince düşüktür. DPS Özellikle konsantre örnekler olarak sıvı bulutlu kanıtladığı düşük tuz tamponu içine seyreltme ile daha az çözünür hale gelebilir, ancak tamamen küçük Amou ilavesiyle çözündürülmüş edilebilir5 M NaCl çözeltisi nt (ek 10-20 mm).
- SP tampon A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM NaCI, 0.1 mM EDTA) ile 30 ml'lik bir SP Sefaroz Hızlı Akışlı kolon dengelenmesi. 1.5-2 ml / arka plan üzerinde 0.3 MPa'lık bir basınç limiti olan dk kolonu boyunca tampon çalıştırın. Sütun üzerine örnek yerleştirin. OD 280 iz dönene kadar başlangıca SP Tampon A ile yıkayın ve flow-through atın. 2 ml'lik fraksiyonlar toplarken, 0-100% Tampon B, 150 ml'lik bir doğrusal gradyan çalıştırın. % 10 değişim mümkün olsa DPS, yaklaşık 50% B keskin bir tepe Zehir olacaktır.
- % 15 SDS-PAGE jel üzerinde elüsyon kesirler çalıştırın ve bir spektrofotometre kullanılarak OD 260 / OD 280 oranı ölçülerek DNA kontaminasyonu kontrol edin. Jel sadece 19 kDa civarında bir grup göstermelidir, ve OD 260 / OD 280 0.7 civarında tipik olarak. Saf DPS kesirler havuzu. Bir ile bir santrifüj filtre ünitesi (örneğin Amicon Ultra Filtrasyon Ünitesi gibi) kullanın10K molekül ağırlığı kesme DPS konsantre ve depolama tampon (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM NaCl) içine alışverişinde. -80 Depolama için sıvı nitrojen içinde kısım arıtıldı DPS ve dondurma ° C
2. DNA koruma deneyi
Tahlil birden fazla zaman duyarlı adımdan oluşuyor ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için ikinci zamanlı olmalıdır. Birçok maddeler ve pipetleme adımlar söz konusu, bir pipetleme tablo (Tablo 1) adım ve hacimleri takip etmek için tavsiye edilir böylece. Tahlil için gereken toplam süre en fazla 3 saat olduğunu.
- Hava geçirmez bir şişenin içine 30 ml su ölçün; çözüm oksijen kaldırmak için 10 dakika (iki şırınga iğneleri, sıvı bir, yukarıda birini kullanarak) için N 2 ile su yıkayın. 2 mM stok solüsyonu elde etmek için suya 0.0168 g FeSO 4 • 7H 2 O ekleyin. Flakon Seal ve karıştırın sonra, daha 5 dakika azot ile yıkayın. Çözüm olmalıdıraçık, sarı herhangi bir ipucu tespit ise, yeni bir demir solüsyon hazırlanır.
- Buz üzerinde tutmak ve alüminyum folyo ile sararak ışıktan korumalı, H 2 O 2 çözeltisi (1 ml suya 9.2MH 2 O 2 10.87 ul) 100 mM olun. Spontan çürüme nedeniyle hazırlandıktan sonra yaklaşık 1-2 saat için kullanın. Hidrojen peroksit stok kısmen uygun depolama (karanlıkta, 4 ° C'de) tarafından ıslah olabilir arıza, benzer tabidir. OD 240 ölçerek stok konsantrasyonu düzenli olarak kontrol tavsiye edilir.
- Bir oda sıcaklığında su banyosunda hızla DPS saflaştırılmış bir kısım Çözülme ve buz üzerinde tutmak. Çökelti agrega için bir masa üstü picocentrifuge 4.000 x g'de 10 saniye santrifüj. Bir spektrofotometre (OD 280 = 1.547 100 mcM monomer DPS bir konsantrasyon gösterir) kullanarak santrifüj sonra konsantrasyon ölçün.
- 12x reaksiyon tamponu (1 kullanarak yüksek konsantrasyon stoktan lineer DNA sulandırmakNg / ml 'lik bir konsantrasyonda 100 M MOPS-KOH pH 7.0, 1 M NaCI). Lineer DNA miktar kolaylaştırmak için kullanılır, ancak plazmid DNA sıra kullanılabilir.
- Bir PCR tüpü içine DNA tampon karışımı pipetle 1 ul. Nihai reaksiyon hacmi (eksi SDS), 12 ul olacak, böylece, reaksiyon içine yeterince su ilave edilir. Bu miktar pipetleme tablosunu kullanarak önceden hesaplanmalıdır. 3 mcM son bir dodecamer konsantrasyonu DPS ekleyin. DPS DNA'ya bağlamak için izin vermek için, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
- Istenen konsantrasyona ulaşmak için yeterli 2 mM FeSO 4 çözüm ekleyin. Tipik bir deneyde, 0, 1 mM FeSO 4 ile bir konsantrasyon aralığında kullanılmaktadır. Daha yüksek konsantrasyonlarda daha geniş bir DNA bozulmaya sebep olacak, ama aynı zamanda demir, reaksiyon karışımı içinde çökeltilerinin oluşmasına neden olabilir. Çabuk 100 mm H2O 2 çözeltisi (10 mM nihai konsantrasyona kadar) 1 ul ekleyin ve Fenton izin vermek için 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübeGerçekleşmesi-aracılı bozulması tepki.
- % 20 SDS (sodyum dodesil sülfat), 0.8 ul ekleyin. Mix ve DPS-DNA kompleksleri bozmaya 5 dakika 85 ° C'de inkübe edin. SDS DPS-DNA kompleksi destabilizes ve miktar kolaylığı artırır DNA, için istenmeyen jel vardiya önler. Isteğe bağlı bir adım toksik olmayan ürünler haline katalitik olarak kırıcı hidrojen peroksit ile reaksiyon durdurmaktır. Bu protokol açıklanan koşulları için, bu adımı DNA bozulması geniş bir aralığı elde etmek için gerekli değildir.
- Boya yükleme ekleyin, 1 dakika buz üzerinde inkübe ve bir agaroz jel üzerinde yük. Jel çalıştırın ve etidyum bromür kullanarak DNA leke. Jel jel etidyum bromür dağılımı ile engellemesini önlemek için SDS, elektroforez sonrası lekeli yerine elektroforeze tabi tutulmadan önce olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan DPS için arıtma işlemi çok tekrarlanabilir. Tanımlanmış bir protokole göre DPS arıtma, E. 2 L kullanılarak bir başlangıç noktası olarak coli kültür, genellikle 5 ila 12 mikron arası konsantrasyonlarda 12 DPS içeren proteinin 2.5 ml verecektir. Daha uzun indüksiyon kez (4 saat) Bu değişkenliği azaltmak gibi görünüyor. Protein saflığı SDS-PAGE jel (Şekil 1) ile kanıtlandığı gibi,% 99 üzerinde sürekli olarak. DNA kirlilik düzeyi olarak hem DNA ve OD 260 / OD 280 oranı boyanmış agaroz jel kanıtladığı, sürekli ihmal edilebilir düzeydedir. Bu değer değişebilir, ama değerler DNA kontaminasyonu seviyeleri de% 5 altında kalması olduğunu belirten, 0.9 üzerinde asla.
DNA koruma deneyi sonuçlarını tekrarlanabilirliği yürütülmesi üzerine büyük ölçüde bağlıdır. Tüm içerik maddelerinin konsantrasyonu tam olarak ölçülmesi durumunda (özellikle protein konsantrasyonu sonrası centrörnekler için ifugation) eklenmiş ve inkübasyon sürelerinde tutarlıdır, sonuçlar sürekli olarak Şekil 2'de gösterildiği gibi, bu benzeyecektir. Koşulları daha az ideal ise artan demir konsantrasyonu ile DNA bozulması genel bir artış hala belirgin olmasına rağmen, testler arasında küçük farklılıklar, görünür olacaktır. DNA koruma deneyi ile elde edilen sonuçları, ImageLab gibi görüntü işleme yazılımı aracılığıyla ölçülebilir. Şekil 3 bu miktar sonucunu gösterir, üç testleri üzerinden ortalama. Hata çubukları elde tekrarlanabilirlik genel yüksek seviyesini gösterir.
Şekil 1. . SDS-PAGE (1) Hücresiz özü ile analiz DPS saflaştırılması ara adımlar,, (2) içinden akan DEAE Sepharose sütununun, DEAE sütun (3) sıyırma sıvısı, (4)% 60 amonyum sul süpernatan kader yağış, (5) PD-10 sütuna göre% 90 amonyum sülfat yağış ve tampon değişimi takip DPS örnek; (6) SP sepharose kolon sonra saf DPS fraksiyonlar toplanmış; (7) protein molekül ağırlığı işaretleri. Görüntü miktar yazılım (ImageQuant TL) tarafından belirlenen her sokağın altındaki yüzdeler DPS saflık göstermek.
Şekil 2. Oksidatif bozulması DNA DPS-aracılı koruma. Tüm şerit doğrusal 5 kb DNA 100 ng içerir. (1) DNA, yalnız, (2), DNA 1 mM H2O 2, 1 mm H2O 2 ve 166 uM FeSO 4 (3), DNA, (4) ila (8) DNA, 3 uM DPS 12, 1 ile mM H 2 O 2, ve soldan sağa artan demir konsantrasyonu (0 mcM, 166 mcM, 333 mcM, 666 mcM ve 1000 mcM).
Şekil 3,. Demir konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak hasar görmemiş fraksiyon DNA, DNA koruma deneyi üç tekrar hesaplanmıştır. Hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını temsil eder. Koşullar: 5 kb doğrusal DNA 100 ng, 1 mM H2O 2, 3 uM DPS 1 x reaksiyon tamponu (83 mM HEPES-KOH, pH 7.0, 83 mM NaCI) içinde 12. Protein kontrolü yok 0 uM'lik bir konsantrasyon ile DPS 12 hariç olmak üzere, aynı koşullar kullanılarak gerçekleştirildi.
Tablo 1. Temel bir pipetleme tablo örneği. Soldan sağa sırayla, bir anda her sütun için pipetleme yapın. Her pipetleme adım takip inkübasyon süresi gösterilirson sırada. Maddelerin havuzu DNA ve proteinin her ikisi de ortak bir malzemeyi ihtiva eden bir tüp pipetle gerektiğini gösteren, sütun 3 ve 4 hücreleri arasındaki artı işareti ile gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede açıklanan DPS bir arınma süreci çok sağlamdır. Saflık sürekli (>% 99) yüksek olmuştur; başka proteinler görünür bantları gibi SDS-PAGE jel görünür. DPS çok yüksek konsantrasyonları ile inkübe, kısmi DNA yıkımı ile kanıtlandığı gibi buna rağmen, saflaştırılmış DPS bazı gruplar, nükleaz aktivitesi var gibi görünmektedir. Bu, arıtma yoluyla kaldırmak koyamadık, düşük konsantrasyonda yüksek derecede aktif DNase'lann varlığına işaret olabilir. Bununla birlikte, bu DNA yıkımı yalnızca tipik olarak in vitro tahlillerde için kullanılmaz konsantrasyonlarda görülmektedir, bu nedenle genellikle bir sorun teşkil etmez.
Bu makalede sunulan DPS arıtma protokolü birçok güçlü noktaları vardır. Protein yakınlık etiketli olmak zorunda değildir, fonksiyonu ile müdahale hiçbir imkanı var bu yüzden. Saflaştırılmış proteini DNA içermeyen, bu nedenle in vitro tahlillerde DNA-bağlama özelliklerini zarar vermez içerenolası kirlenme eserler. Son olarak, saflaştırılmış DPS demir miktarının 18, 19 ferene yöntemi ile, proteinin boşluğunun içine depolanan hemen hemen hiç demir (<1 demir atomuna / DPS dodecamer) içerir. Bu özelliği sayesinde tam DPS boşluğunun içine yüklü olanla kontrol etmek ya da müdahale ile ilgili endişeleri olmaksızın bir mikro-reaktör gibi karmaşık içi boş DPS kullanmayı kolaylaştırır.
DNA koruma deneyi in vitro DPS tedavi edici özelliklerini karakterize etmek için hızlı ve güvenilir bir yoldur. Bu teknik fiziksel hücre canlılığı üzerinde DPS ifade koruyucu etkisini göstermek için basit bir yöntem sunmaktadır. Tahlil oksidatif hasara karşı DPS veya diğer enzimler tarafından sağlanan DNA koruma derecesi hakkında nicel veriler elde etmek için kullanılabilir, ve birkaç adım yeniden üretimi artırmak için alınabilir.
Reaktif hazırlık doğru concentratio olarak, önemli bir aşamadırN ölçüm gereklidir. Bu DNA konsantrasyonu ölçümleri arasındaki dalgalanma olmadığından emin olmak için tüm deneyler için aynı DNA stok kullanmak en iyisidir. Bizim durumumuzda bir Maxiprep kiti (Promega) kullanılarak plazmid DNA birkaç miligram ekstre edilmiş ve tek bir kesici kısıtlama enzimi kullanarak doğrusal parçaları içine sindirilir. Ayrıca, çözme sonrası DPS protein refreeze yok, dondurma ve faaliyet düşürebilir çözülme tekrarlanan her zaman olduğu gibi taze bir kısım ile çalışır. Deney protein aşırı kaybını önleyecektir gerektirir DPS hazırlanması, yaklaşık olarak aynı hacimde arınma süresi alikotları. Ölçüm konsantrasyonu önemlidir önce hızlı bir şekilde protein santrifüj gibi başka protein agregatlarının olarak aktif bir protein konsantrasyonu aşırı tahminler yol açar. Son olarak, reaktifler H 2 O 2 ve FeSO ile H 2 O 2, DNA ile, tek başına beklenen (örneğin DNA olarak DNA çalışıp çalışmadığını izlemek için birkaç örnek adıyorum DNA koruma testi inkübasyon sürelerinde oldukça duyarlıdır, her adımda mümkün olduğunca doğru zamanlı olması bu yüzden. Çok sayıda deney yaparken, bu kuluçka süresi örnekler arasında sabit kalmasını sağlamak için örnekler sendeleyip tavsiye edilir. Birden fazla deneyler üzerinden ortalama tutarsız kuluçka zamanlarda ortaya herhangi bir hata temizlenmesine yardımcı olur, ama genel hata hassas zamanlama azaltılabilir. Birkaç ipucu DPS dışında proteinler (ya da kimyasal) için DNA koruma testi optimize araştırmacılar için önerilebilir. Optimize etmek için en önemli DNA miktarı, radikal üretim hızı ve araştırılmaktadır koruyucu etkinin büyüklüğü arasındaki oranlarını gösterir. Optimum oran bulunana dek, DPS kullanarak birçok deneyleri DNA tamamen yok ya da enzimin görünür hiçbir koruyucu etkisi ya da göstermiştir. Pe için deneyimlerimiz, etkili bir şekildeBu optimizasyon rform protein oldukça yüksek konsantrasyonda seçmektir, oversaturating olmadan jel üzerinde açıkça görülebilir olacak bir DNA miktarını seçin ve mevcut DNA'nın tüm tahrip edildiği H 2 O 2 ve FeSO 4 belirli konsantrasyonları belirler. Bundan sonra, sıfır ve tespit edilen değer arasındaki FeSO 4 konsantrasyonlarının aralığı kullanılarak bir seri ölçüm DNA koruma bir dinamik aralığı ortaya çıkaracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, ve yararlı tartışmalar için Kourosh Azim Honarmand İbrahimi minnettarız. Bu çalışma Delft Teknoloji Üniversitesi'nden finansman start-up tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 | |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 | |
| Sodium chloride | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 | |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 | |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem | 475898 | |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Static incubator | Hettich | INE500 | |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA | |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA | |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Syringe needles | BD | 305128 | |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
- Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
- Chiancone, E., Ceci, P. The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding. Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).
- Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).
- Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter. Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).
- Martinez, A., Kolter, R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps. J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).
- Nair, S., Finkel, S. E. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase. J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).
- Zhao, G., Ceci, P., et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).
- Ceci, P., Cellai, S., et al. DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus. Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).
- Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core. J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).
- Swift, J., Wehbi, W. A., et al. Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities. Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).
- Ceci, P., Chiancone, E., et al. Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant. Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).
- Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).
- Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties. Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).
- Kumar, M. Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage. Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).
- Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid. Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).
- Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
- Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).
- Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. Serum iron determination using ferene triazine. Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).
