Поколению прав кардиомиоцитов: Дифференциация Протокол от Ф-свободной человеческой индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Summary

Плюрипотентных стволовых клеток, или эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных), клетки представляют собой ценный источник человеческого дифференцированных клеток, в том числе кардиомиоциты. Здесь мы сосредоточимся на сердечную индукции клеток IPS, показывающий, как использовать их, чтобы получить функциональные человеческие кардиомиоциты через эмбриональные тельца-протоколу.

Abstract

Для того, чтобы расследовать события вождения развития сердца и определить молекулярные механизмы, приводящие к инфаркту заболеваний у людей, очень важно для создания первого человека функциональные кардиомиоциты (CMS). Использование этих клеток в лекарств и токсикологических исследований также было бы весьма полезным, позволяя новых фармакологических молекул для лечения нарушений сердечного быть подтверждено предварительно клинически на клетки человеческого происхождения. Из возможных источников КМ, индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клетки являются одним из наиболее перспективных, так как они могут быть получены непосредственно из легкодоступных ткани пациента и имеют внутреннюю способность давать начало всем типам клеток тела ^1. Некоторые методы были предложены для дифференциации плюрипотентных клеток в КМ, от классического эмбриональных телец (ЕВ) агрегирование подход к определенным химическим протоколы ^2,3. В этой статье мы предлагаем ЭТ-протоколу и показать, как это метод может быть использована для эффективной генерации функциональных CM-подобные клетки из без фидерного слоя плюрипотентных клеток.

Introduction

Исторически сложилось, что исследование генетических и молекулярных механизмов вождения человеческого развития и болезни было основано на поколение генетически модифицированных животных моделях. Тем не менее, многочисленные человеческие фенотипы не могут быть успешно воспроизведена в мышах, в основном из-за биологических различий, существующих между двумя видами. С другой стороны, доступ к ткани человека может быть ограничен и зачастую не обеспечивают достаточное количество материала должно быть получено для углубленных экспериментальных исследований. Области сердечно-сосудистой биологии и страдает от этих ограничений: физиология человеческого сердца значительно отличается от мыши, и значительное количество ткани сердца доступна только посмертные или во время операции на сердце. Поиск оптимального источника для разграничения функциональных человека КМ Таким образом, становится центральной темой в сердечно-сосудистой биологии и много усилий было сделано для решения этой проблемы. Различные типы клетки были предложены, яncluding скелетных миобластами, местные сердечных стволовых клеток, мононуклеарных клеток костного мозга, эндотелиальные предшественники, и мезенхимальных стволовых клеток. Однако данные, полученные с использованием этих клеток не была последовательной ^4.

Вывод человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) первые ⁵ и новаторские открытия индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток Яманака и Thomson ^6,7 позже, видимо, обеспечивает решения: эти клетки обладают способностью расти бесконечно, и потенциал, чтобы дать подняться на все клетки производные трех зародышевых листков, в том числе КМ. Применение плюрипотентных клетках предлагает дополнительные преимущества: были построены на основе аутологичных клеток взрослой, они обладают таким же генома человека или пациента, из которых они получены. Поэтому они позволяют развитие в пробирке моделей, способ исследования человеческих генетических заболеваний и механизмы развития. В силу этой особенности плюрипотентных клеток также может Øvercome проблемы, связанные с иммунным отторжением и этические вопросы ^8. По этим причинам, хотя ЭСК все еще представляют собой золотой стандарт в области биологии стволовых клеток, исследователи по всему миру в настоящее время переход к более клеточной технологии IP-адресов.

плюрипотентных клеток в настоящее время используются для моделирования болезней человека в пробирке при различных условиях, включая врожденные сердечно-сосудистых расстройств ^9,10. В последнее время применение плюрипотентных моделирования заболевании клетки была выполнена для моногенных расстройств сердечного (то есть задолго синдрома QT, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия) и патологий, в котором пороки сердца являются частью сложного фенотипа (т.е. Leopard и Тимоти синдромов, дилатационная кардиомиопатия). Эти отчеты подтвердили, что пациент-специфические плюрипотентных клеток, которые дифференцируются в КМ экран как фенотипические и функциональные характеристики, как и болезнь в естественных условиях.

Однако существуетпо-прежнему много проблем для повышения эффективности индукции плюрипотентных клеток в сердечной линии. Спонтанное возникновение сервера почтовых ящиков из ЭСК человека через образование агрегатов называют эмбриональные тельца (ЭТ) оказались успешными ^17. После этого открытия, многие другие методы были предложены. Многие группы значительно повысить эффективность дифференциации протокола и перешли к определенным химическим и животных, свободных от произведений культуры реагентов (см. лицедейство, К., и др.., Circulation исследований (2012) для всеобъемлющего обзора всех существующих методов ³ ).

Тем не менее, классический метод, основанный на EB агрегации еще представляет чаще всего используются для выполнения функциональных исследований и исследования механизмов болезни. Предлагаемый протокол основан на агрегацию клеток плюрипотентных в ЭТ и культуры в присутствии сыворотки и аскорбиновая кислота, которая была показана для повышения сердечной процесс дифференциации и роsitively повлиять на созревание этих клеток ^18,19. В этой статье мы рассмотрим эту методику в деталях и покажет, как использовать без фидерного слоя линий плюрипотентных ячейки для создания конкретного пациента полученных ИПС-CMS.

Protocol

1. Без фидерного слоя Техническое обслуживание и пассажи клеток человека плюрипотентных Линии Подготовьте Матригель покрытием блюд. Оттепели один флакон человека ESC-квалифицированный матрицы на льду в течение одного часа и разбавить его в 25 мл среды DMEM-F12 среду. Добавить 1 мл до 35 ?…

Representative Results

В наших исследованиях мы сгенерировали КМ от нескольких линий плюрипотентных ячейки. Эти строки были изначально формируется на слое подачи MEF, но были немедленно помещены на матригеле использованием определенной среде (либо mTESR1 или Nutristem). Различные анализы были использованы для прове…

Discussion

Плюрипотентных стволовых клеток есть потенциал, чтобы дифференцировать спонтанно в КМ, хотя и с низкой эффективностью и высокой вариабельности линий. Разработку новых методов индукции сконцентрировала свое внимание на повышении эффективности процесса и движется в сторону более опр?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon